蘇木乙酸乙酯提取物對大鼠同種異位心臟移植急性排斥外周血中TNF－α水平的影響

周洪波，史海蛟，周亞濱

(1．黑龍江中醫藥大學，黑龍江 哈爾濱 150040;2．黑龍江中醫藥大學附屬第一醫院，黑龍江 哈爾濱 150040)

目前，臨床所用的免疫抑制治療措施均屬非特異性治療，主要是免疫抑制藥物，還包括抗血清等生物制劑、外科手術和放射治療等。在器官移植手術后病人如果出現急性排斥反應，常需長期服用大劑量的免疫抑制劑。但目前的免疫抑制劑一方面僅破壞大多數免疫活性細胞，而對剩余的和新生的淋巴細胞影響較小，因此不能完全消滅免疫排斥反應。另一方面目前人們常用的免疫抑制劑常因價格昂貴，毒副作用大等原因，使用受到限制。因此，免疫抑制劑的開發與應用，有著十分廣闊的前景。在本實驗中，我們制造了同種異位心臟移植的大鼠模型，并使用蘇木乙酸乙酯提取物對其進行抗免疫排斥治療。

1 材料和方法

1．1 實驗用動物 Wistar大鼠，雄性，體質量160～200g;SD大鼠，雄性，體質量230～250g。均購自黑龍江中醫藥大學實驗動物中心。

1．2 實驗用藥物 環胞素A:將環孢素軟膠囊(華北制藥股份有限公司生產，每粒含環孢素A25mg)溶解于橄欖油中，制成3.5mg/ml濃度，4℃環境中保存備用。

蘇木乙酸乙酯提取物:蘇木，購自于黑龍江省藥材公司，產地:云南，經生藥鑒定。將蘇木粗粉(40目)浸泡入75%的乙醇中4h，加熱至85℃，連續回流提取2h，過濾;此過程反復2次，將濾液合并，加入旋轉蒸發器中水浴蒸干，于真空干燥箱中烘干，獲得乙醇提取干粉。將乙醇提取干粉倒入雙蒸水混懸，并用乙酸乙酯萃取、回收得到蘇木乙酸乙酯提取物。

1．3 實驗用試劑 大鼠TNF－αELISA試劑盒、橄欖油、慶大霉素注射液、水合氯醛、肝素鈉注射液(以生理鹽水配制成500u/ml和25u/ml的肝素生理鹽水)、心臟停搏液、甲醛。

1．4 模型的建立 行大鼠腹腔同種異位心臟移植術，采用Ono術式，將供心的升主動脈與受體的腹主動脈，供心的肺動脈與受體的下腔靜脈分別吻合，建立大鼠同種異位心臟移植模型。

1．5 實驗分組及給藥 移植術后將2h內蘇醒、能站立，手指稍用力便可觸及移植心臟跳動并且24h內不停跳的大鼠作為實驗用動物，并給予單籠飼養。將上述大鼠隨機分成4組，每組各8只。模型對照組，按體

基金項目:國家科技重大專項課題(2009ZX09103－425)

作者簡介:周洪波(1983－)，男，黑龍江中醫藥大學2009級中醫內科學專業碩士研究生。

通訊作者:周亞濱 (1963－)，男，主任醫師，教授，主要從事心血管內科的教學、科研及臨床工作。

收稿日期:2012－09－01

修回日期:2012－10－22

重計算等容量橄欖油于術后24h給予大鼠灌胃。CsA組，將CsA溶解于橄欖油中于術后24h按35mg/kg/d灌服給藥。蘇木乙酸乙酯加半量CsA組，將蘇木乙酸乙酯提取物和CsA溶解于橄欖油中于術后24h給予蘇木乙酸乙酯提取物按含生藥量1.15g/kg/d加CsA17.5mg/kg/d灌服給藥。蘇木乙酸乙酯組，將蘇木乙酸乙酯提取物溶解于橄欖油中于術后24h按含生藥量1.15g/kg/d灌服給藥。

1．6 采集血液與組織 術后移植心臟心跳滿7天的大鼠于當天取血及移植心臟;移植心臟心跳不滿7天的大鼠于移植心臟停跳時取血及移植心臟。

取血:術后7天予大鼠眼眶下靜脈采血，離心，取血清，備用。

1．7 外周血細胞因子 TNF－α濃度測定 采用ELISA法進行檢測。

1．8 統計學處理 多個樣本均數的比較采用F檢驗，多重比較采用SNK－q檢驗。

2 結果

2．1 一般情況 移植術后大鼠多在2～4h內蘇醒，能站立，心臟搏動比較規則、有力。4h內多可進食物及水。3～4天后腹部刀口基本愈合。模型對照組一般情況相對較差，懶動。CsA組進食量較少，懶動、皮毛無光澤。蘇木乙酸乙酯加半量CsA組及蘇木乙酸乙酯組一般情況相對較好，進食及活動量相對較多，皮毛光澤較好。

2．2 血清中TNF－α的水平

CsA組、蘇木乙酸乙酯加半量CsA組、蘇木乙酸乙酯組與模型對照組相比血清TNF－α水平均明顯下降(P＜0.05，P＜0.01)。見表1。

表1 各組心臟移植后TNF－α的血清水平(±s)

表1 各組心臟移植后TNF－α的血清水平(±s)

注:與模型組相比，*P ＜0．05，＊＊P ＜0．01。

組別 n TNF－α(pg/ml)模型組8 86．28 ±11．21 CsA 組 8 63．58 ±5．17＊＊蘇木乙酸乙酯加半量 CsA組 8 64．13±5．30＊＊蘇木乙酸乙酯組 8 75．03 ±9．97*

3 討論

1975年Carswell等研究發現，給予接種卡介苗的小鼠注射脂多糖以后，可以在其血清中檢測出一種活性物質，可引起腫瘤出血、壞死，將其稱為腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor，TNF)，當時把 TNF分為 α 和β兩種，TNF－α由活化的單核－巨噬細胞產生，又稱惡液素。IL－1、IFN－γ、M －CSF、GM －CSF對單核 －巨噬細胞產生TNF－α有刺激作用，TNF－α本身有正反饋的刺激作用。C5a趨化因子、免疫復合物、病毒、真菌、寄生蟲抗原、外毒素等均是TNF－α產生的刺激劑。TNF－α的生物學功能主要包括殺傷或抑制腫瘤細胞、調節細胞的分化、促進細胞增殖、抗病毒作用、促炎活性和免疫調節作用等。研究發現，在器官移植排斥反應發生的早期，TNF－α可使移植器官抗原的表達增加，從而促進移植術后排斥反應的發生［1－2］。TNF－α被認為是炎癥反應中最重要的啟動因子，它可以促進中性粒細胞聚集，活化凝血因子，并進一步促進 IL －1、IL －6、IL －8、氧自由基等介質的釋放［3］。此外，在排斥反應中形成的TNF－α可促進IL－8的表達增多，誘導血管內皮細胞產生粘附分子增多，從而誘導中性粒細胞、淋巴細胞及單核巨噬細胞等穿過血管壁向移植器官遷移，引起移植器官出現大量免疫細胞浸潤［4］。以上機制共同參與心臟移植術后的急性排斥反應過程，最終導致效應T細胞對靶細胞的攻擊，移植心肌細胞凋亡。本實驗結果表明，CsA組、蘇木乙酸乙酯加半量CsA組、蘇木乙酸乙酯組與模型對照組相比，血清TNF－α水平均明顯下降，而且差異均具有統計學意義。CsA組、蘇木乙酸乙酯加半量CsA組與蘇木乙酸乙酯組相比，血清TNF－α水平降低得更明顯。而CsA組與蘇木乙酸乙酯加半量CsA組相比，血清TNF－α水平差異無統計學意義。本實驗結果證實，蘇木乙酸乙酯提取物可以降低血清TNF－α的水平，抑制同種異位心臟移植大鼠急性排斥反應，減少環孢素的給藥劑量，是一種有效的抗排斥成分。

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