黃藥子毒性組分對肝細胞內Ca2+濃度的影響

王加志，劉樹民，湯青，李偉

(1．黑龍江中醫藥大學佳木斯學院，黑龍江 佳木斯 154007;2．黑龍江中醫藥大學中醫藥研究院，黑龍江 哈爾濱 150040)

黃藥子臨床應用時肝損害時有報道［1］，表明人們對用藥安全的關注日益加深。本研究組前期研究發現，黃藥子的肝損害作用與氧化應激有關［2］。本研究通過對肝細胞內Ca2+濃度的初步研究，探討氧化應激與肝細胞內Ca2+的變化情況，為從細胞凋亡及信號轉導方面研究中藥肝損害奠定基礎。

1 儀器與試劑

1．1 實驗儀器

LSM－510－META激光共聚焦掃描顯微鏡(德國ZEISS公司);倒置式顯微鏡(Axiovert 200 MBP);BQ 50－1J恒流泵(河北保定蘭格恒流泵有限公司);KDC－160HR高速冷凍離心機(科大創新股份有限公司中佳分公司)。

1．2 試劑

FLUO－3 AM(美國分子探針(AP)公司);胰蛋白酶(美國SIGMA公司);Ⅳ型膠原酶(美國SIGMA公司);PBS(美國SIGMA公司);DMEM培養基(美國SIGMA公司);DMSO(美國SIGMA公司);試劑均為國產分析純。

1．3 實驗動物

雄性SD大鼠4只，體質量(250±20)g，由黑龍江中醫藥大學藥物安全評價中心(GLP)提供，動物質量合格證書號:醫動字第01－10－2號。

1．4 實驗藥物

黃藥子購于黑龍江省藥材公司，產地河北，經黑龍江省藥檢所鑒定為薯蕷科植物黃獨(Dioscorea bulbifera L．)的塊莖。黃藥子二萜內酯類組分制備按前期實驗［3］，其在原藥材中含量為 0．568%。

1．5 動物分組及給藥量

SD大鼠4只，分為空白對照組、肝毒性組各2只，灌胃給藥，肝毒性組給藥量為0．064 8g/kg，相當于生藥2．85g/kg。日兩次，空白對照組為含吐溫－80同等濃度的蒸餾水，共7天。

1．6 樣品制備

1．6．1 細胞內Ca2+測定樣品

取SD雄性大鼠4只，于末次給藥12h后，斷椎處死，把整個動物浸入盛有75%乙醇的燒杯中數秒鐘消毒，取出后放在大平皿中攜入超凈臺。用消毒的剪刀剪開腹部皮膚，暴露肝臟，置于無菌灌流臺中，加膠原酶50mg于滅菌的 PBS液200ml中，循環灌洗肝臟15min，然后用眼科手術剪刀仔細將組織反復剪碎，直到成1mm3左右的小塊，再用PBS清洗，移入無菌離心管中，加入0．25%的胰蛋白酶適量，37℃水浴中消化8～10min，每隔幾分鐘搖動一下試管，使組織與消化液充分接觸，靜止，吸去上清，向離心管中加入5～10ml含5%小牛血清的DMEM培養基，用吸管吹打混勻，即得。

1．6．2 FLUO －3 AM 工作液的配制

FLUO－3 AM 50μg溶解于40μl無水二甲基亞砜(DMSO)中即成貯備液，貯備液加入DMEM培養基

基金項目:黑龍江省中醫藥管理局資助課題(ZHY10－Z02)

作者簡介:王加志(1977－)，男，副教授，博士，主要從事中藥藥性理論研究。

通訊作者:劉樹民(1963－)，男，教授，博士研究生導師，主要從事中藥臨床藥效物質基礎研究及中藥藥性理論研究。

收稿日期:2012－06－12

修回日期:2012－07－10

10ml即得4．4μm 的工作液。

FLUO－3的共聚焦顯微鏡激發光峰值波長為490nm，用于檢測的熒光峰值波長為525nm，掃描點面積 0．053 1mm2。

1．6．3 FLUO －3 染色方法

使用時按實際情況將工作液適當稀釋，最低稀釋至濃度為2μm。取細胞懸液100μl，加入10μl熒光染料，加入DMEM培養基至1 000μl，培養箱中37℃反應15min后測定，從染料加入到測定完成，不超過40min。本實驗使用的濃度為2．2μm。

2 結果

細胞內Ca2+測定結果:在生理情況下，Ca2+作為細胞內第二信使，在維持細胞增殖、分裂、運動、能量代謝、氧代謝、Ca2+依賴蛋白激酶和磷脂酶的激活等方面發揮著重要作用。而這種作用的正常發揮則依賴于肝細胞內液約為0.2μmol/L的Ca2+濃度和細胞外液約1．3mmol/L的Ca2+濃度，即肝細胞始終處于胞內外1萬倍濃度梯度差，懸殊的電化學梯度正是Ca2+發揮第二信使作用所必需的，也表明肝細胞內有著強有力的Ca2+穩態調節機制。內質網和線粒體是胞內最主要的鈣庫，因而線粒體和內質網在胞內鈣穩態調節中起著主導作用。以空白對照組大鼠肝細胞內鈣離子濃度為基準，評價干預因素黃藥子毒性組分對肝細胞內鈣離子的影響。

空白組:空白組細胞數量多，形態規整，熒光染料染色均一，亮度適中，以背景形鮮明對照，適合觀察，證明以fluo－3為熒光染料負載的細胞懸液樣品制備成功。

黃藥子組:同等條件下制備的細胞懸液中，細胞數量最少，在相同的觀察條件下，細胞的熒光亮度最強，說明細胞內游離Ca2+含量增高。結果見圖1。

3 討論

本實驗使用激光掃描共聚焦顯微鏡技術和新一代的胞內游離Ca2+探針fluo－3/AM(典型的單波長熒光探針)，發射波長較長，熒光選擇性強，自身無熒光，只有與乙酰甲酯AM相連方可進入細胞內，被細胞內酯酶水解并與游離鈣結合后才發出熒光，能有效地避免非特異性染色，不需要紫外光激發，避免了紫外光對活細胞樣品的損傷，不需要制作工作曲線。

Ca2+作為主要的細胞內信使，同時也是內質網－線粒體交流的主要“語言”，與凋亡密切相關。細胞質內鈣離子濃度的升高會導致鈣離子轉移到線粒體［4－5］，引起線粒體 Δψm 下降，損傷線粒體，誘導細胞凋亡。線粒體膜的損傷又可導致Ca2+進一步升高，形成惡性循環，加重細胞的損害。

圖1 鈣離子激光共聚焦掃描圖

黃藥子可損傷肝細胞線粒體，并生成大量的氧自由基［3］，線粒體損傷后，肝細胞ATP缺乏，胞膜受損，跨膜Ca2+內流增加，內質網等胞內鈣庫釋放Ca2+增多，胞膜Ca2+泵排Ca2+能力和內質網膜Ca2+－Mg2+－ATP酶攝Ca2+能力減弱，結果導致胞漿內鈣超載，線粒體保護性攝取胞漿內游離Ca2+以平衡鈣穩態，最終會導致自身鈣超載，故肝細胞鈣超載必然伴隨線粒體鈣超載。

［1］李維昌，楊軍，李惠文，等 黃藥子致藥物性肝病1例［J］．臨床合理用藥，2009，2(15):79．

［2］李偉，趙艷，湯青，等．黃藥子醇提物肝臟毒性部位篩選研究［J］．中醫藥信息，2009，26(1):28 －29．

［3］王加志．黃藥子中二萜內酯類成分對大鼠肝細胞損傷作用的實驗研究［J］．藥物不良反應雜志，2009，11(1):13 －16．

［4］洪莉，蔡威．凋亡與肝細胞損傷機制的研究進展［J］．臨床小兒外科雜志，2006，5(1):42 －46．

［5］Kim JH，Choi S，Jung JE，et al．Capacitative Ca2+entry is inv － olved in regulating soluble amyloid precursor protein(sAPPα)release me-diated by muscarinic acetylcholine receptor activation in neuroblastoma SH － SY5Y cells［J］．J Neurochem，2006，97(1):245－254．