復方雙氯芬酸辣椒巴布貼微生物限度檢查方法的驗證

王 薇，鄭漢平，廖祥茹

復方雙氯芬酸辣椒巴布貼含有雙氯芬酸二乙胺、辣椒堿、冰片等，有較強的抗菌作用。依據《中國藥典》2010年版［1］，本文采用薄膜過濾法對復方雙氯芬酸辣椒巴布貼進行細菌、霉菌及酵母菌計數的驗證，去除其抑菌成分，使加菌回收達到滿意的效果。

1 驗證材料

1.1 樣品 復方雙氯芬酸辣椒巴布貼:規格: 1%，批號:20090118、20090510、20091115，廣州軍區武漢總醫院藥劑科制劑室生產。

1.2 儀器 HTY-2000集菌儀、可拆卸式薄膜過濾器(杭州高得醫療器械有限公司)，微孔濾膜:孔徑0.45 μm(杭州泰林生物技術設備有限公司)，SW-CJ-IFD/T型潔凈工作臺、BSC-1300ⅡA2型生物安全柜(蘇凈集團安泰公司生產)，PYX-DHS隔水式電熱恒溫培養箱(上海市躍進醫療器械廠)，SPX-250B-Z生化培養箱(上海博訊實業有限公司醫療設備廠)。

1.3 培養基 營養瓊脂培養基(批號:101130)、玫瑰紅鈉瓊脂培養基(批號:100114)、營養肉湯培養基(批號:101213)、膽鹽乳糖增菌液(批號: 091029)、改良馬丁培養基(批號:1010122)、溴化十六烷基三甲銨瓊脂培養基(批號:081219)，北京三藥科技開發公司，甘露醇氯化鈉瓊脂培養基(國藥集團化學試劑有限公司，批號:20090713)，蛋白胨(天津市英博生化試劑有限公司，批號: 051209)。

1.4 稀釋劑 pH 7.0無菌氯化鈉蛋白胨緩沖液、0.9%無菌氯化鈉溶液，按中國藥典2010年版二部附錄方法配制。

1.5 菌種 大腸埃希菌(Escherichia coli)［CMCC(B)44102］第4代，金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)［CMCC(B)26003］第4代，枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)［CMCC(B)63501］第4代，白色念珠菌(Candida albicans)［CMCC(F) 98001］第3代，黑曲霉(Aspergillus niger)［CMCC (F)98003］第4代，銅綠假單孢菌(Pseudomonas aeruginosa)［CMCC(B)10104］第3代。

2 菌液制備方法

接種大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、銅綠假單胞菌的新鮮培養物至營養肉湯培養基中，置30～35℃培養18～24 h，分別取上述培養物1 mL，加0.9%無菌氯化鈉溶液9 mL，10倍遞增稀釋制成每1 mL含菌數為50～100 cfu的菌懸液;接種白色念珠菌的新鮮培養物至改良馬丁培養基中，置23～28℃培養24～48 h，取培養物1 mL，加0.9%無菌氯化鈉溶液9 mL，10倍遞增稀釋制成每1 mL含菌數為50～100 cfu的菌懸液;接種黑曲霉的新鮮培養物至改良馬丁瓊脂斜面培養基中，置23～28℃培養5～7 d，加入5 mL含0.05%聚山梨酯80用0.9%無菌氯化鈉溶液，將孢子洗脫。吸出孢子懸液至無菌試管內，取原液1 mL，加含0.05%聚山梨酯80的0.9%無菌氯化鈉溶液9 mL，10倍遞增稀釋制成每1 mL含孢子數為50～100 cfu的孢子懸液。

3 供試液制備

取樣品100 cm2，去掉貼劑的保護層，置于無菌玻璃片上，粘貼面朝上。用無菌紗布覆蓋貼劑的粘貼面，避免貼劑粘貼在一起。將其置于適宜體積并含有聚山梨酯80的0.9%無菌氯化鈉溶液中，用力振蕩至少30 min，作為1∶10供試液，備用。

4 菌落計數方法的驗證

4.1 常規平皿法、培養基稀釋法

4.1.1 試驗組 取1∶10供試液1、0.5 mL與各試驗菌液(大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、白色念珠菌、黑曲霉)1 mL，分別注入平皿中，立即傾注營養瓊脂培養基和玫瑰紅鈉瓊脂培養基，每株試驗菌平行制備2個平皿，分別置30～35℃培養3 d、23～28℃培養5 d，按平皿法測定其菌數。

4.1.2 菌液組 分別取上述稀釋的試驗菌液1 mL注入平皿內，每種試驗菌平行制備2個平皿，測定所加的試驗菌數。

4.1.3 供試品對照組 取1∶10供試液1 mL，按“4.1.1”項下操作，不加菌液，測定供試品的本底菌數。

4.1.4 稀釋劑對照組 取稀釋劑1 mL，按“4.1.1”項下操作。

4.1.5 結果 見表1、表2。可見常規平皿法3次試驗5株菌株均受到了不同程度抑制，而用培養基稀釋法每皿0.5 mL，部分菌仍受到抑制，說明常規平皿法和培養基稀釋法均不能有效去除其抑菌成分，須重新建立細菌、霉菌及酵母菌計數方法的驗證。

表1 常規平皿法回收率測定結果(%)

表2 培養基稀釋法回收率測定結果(%)

4.2 薄膜過濾法

4.2.1 試驗組 取1∶10供試液10 mL加入含100 mL稀釋液的薄膜過濾器中全量過濾，用沖洗液(100 mL/次)沖洗4次。在最后一次加入1 mL (50～100 cfu)各試驗菌(大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、白色念珠菌、黑曲霉)，取出濾膜，菌面朝上貼于已制備的營養瓊脂培養基平板或玫瑰紅鈉瓊脂培養基平板上，平行制備2皿，置30～35℃培養3 d或23～28℃培養5 d。逐日觀察，按平皿法測定其菌數。

4.2.2 菌液組 分別取上述試驗菌液1 mL注入薄膜過濾器內過濾，貼膜。每種菌平行制備2張濾膜，分別測定所加的試驗菌數。

4.2.3 供試品對照組 取1∶10供試液10 mL，按“4.2.1”項下操作，不加菌液，測定樣品本底數。

4.2.4 稀釋劑對照組 取稀釋劑1 mL，按“4.2.1”項下操作。重復試驗3次。

4.2.5 結果 見表3。由表3可見，用400 mL沖洗時，各試驗菌株的回收率均達70%以上。說明薄膜過濾法可用于復方雙氯芬酸辣椒巴布貼的細菌、霉菌及酵母菌計數，沖洗量定為400 mL。

表3 薄膜過濾法回收率測定結果(%)

5 控制菌檢查方法的驗證

5.1 銅綠假單胞菌檢查方法驗證

5.1.1 試驗組 取1∶10的供試液10 mL及銅綠假單胞菌菌液1 mL，接種至200 mL膽鹽乳糖增菌培養基內，于35℃培養24 h。取上述培養物，劃線接種于溴化十六烷基三甲胺瓊脂培養基平板上，培養24 h，按相應控制菌檢查法進行檢查。

5.1.2 陰性菌對照組 取1∶10的供試液10 mL及大腸埃希菌菌液1 mL，接種至200 mL膽鹽乳糖增菌培養基內，方法同“5.1.1”項。

5.1.3 結果 見表4。由表4可見，試驗組檢出銅綠假單胞菌，陰性菌對照組未檢出大腸埃希菌。說明200 mL膽鹽乳糖增菌培養基可以用于復方雙氯芬酸辣椒巴布貼銅綠假單胞菌的檢查。

表4 控制菌銅綠假單胞菌驗證結果

5.2 金黃色葡萄球菌檢查方法驗證

5.2.1 試驗組 取1∶10的供試液10 mL及金黃色葡萄球菌菌液1 mL，接種至300 mL營養肉湯培養基內，于35℃培養24 h。取上述培養物，劃線接種至甘露醇氯化鈉瓊脂培養基的平板上，培養24～72 h，按相應控制菌檢查法進行檢查。

5.2.2 陰性菌對照組 取1∶10的供試液10 mL及大腸埃希菌菌液1 mL，接種至300 mL營養肉湯培養基內，方法同“5.2.1”項。

5.2.3 結果 見表4。試驗組檢出金黃色葡萄球菌，陰性菌對照組未檢出大腸埃希菌。說明300 mL營養肉湯培養基可以用于復方雙氯芬酸辣椒巴布貼金黃色葡萄球菌的檢查。

6 討論

6.1 稀釋劑對照組的菌回收率均大于70%，說明采用含適量聚山梨酯80的pH 7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液作為稀釋液對試驗不產生干擾。

6.2 細菌、霉菌及酵母菌計數采用薄膜過濾法，取1∶10供試液10 mL加入含100 mL稀釋液的薄膜過濾器中全量過濾，用沖洗液(100 mL/次)沖洗4次。此法可有效去除復方雙氯芬酸辣椒巴布貼的抑菌成分。控制菌檢查采用培養基稀釋法，取1∶10的供試液10 mL分別接種至200 mL膽鹽乳糖增菌培養基或300 mL營養肉湯培養基中，依法進行檢查。

［1］ 國家藥典委員會.中華人民共和國藥典(二部)［S］.北京:人民衛生出版社，2010:附錄107-116.