葉下珠總黃酮的半仿生提取工藝

藍峻峰，謝濟運

(柳州師范高等專科學校化學與生命科學系，廣西柳州545004)

草藥葉下珠(Phyllanthus urinaria L.)為大戟科植物的全草，又稱珍珠草、落地油柑、葉后珠、關門草等，具有平肝清熱、利水解毒之效，常用于治療腸炎、肝炎等炎癥及痢疾、尿路感染、無名腫痛等［1-2］。現代醫學研究表明，葉下珠具有抗乙肝病毒和保肝、護肝作用［3］。黃酮類化合物分子由具兩個酚羥基的苯環通過居于中央位置的三碳原子相互連接而成，其分子結構中常連接有甲基、甲氧基及酚羥基、異戊烯基等還原基團，因此黃酮類化合物具有效清除人體內的氧自由基功效，是一種常見的強抗氧劑。黃酮類化合物的生理活性作用較為廣泛，除具有對心腦缺血損傷、肝損傷、心律失常的保護作用外，還具有鎮痛、抗自由基和抗腫瘤等作用［4］。鑒定研究表明，葉下珠植物中含有黃酮類化合物［5］，經體外滅活HBV抗原作用實驗證明總黃酮為其抗病毒有效成分之一［6］。

半仿生提取法是將整體藥物研究法與分子藥物研究法相結合，為經人類消化道給藥的中藥及其復方藥劑創立的一種提取新技術［7］，該法模仿口服藥物在人體胃腸道中的轉運過程，采用選定pH值的酸性和堿性水依次提取得到活性混合物。目前，葉下珠成分提取工藝主要以傳統有機溶劑提取為主［8］，這些方法提取有機溶劑殘留量大，副作用高，且提取效率低，成本高。本研究運用半仿生法原理，用特定pH的水溶液為溶劑，提取葉下珠黃酮，并用正交實驗優化其提取工藝。

1 材料、試劑及儀器

1.1 材料及試劑葉下珠草藥，購于廣西柳州市中藥材市場，經覃逸明博士鑒定為大戟科葉下珠(Phyllanthus urinaria L.)全草。蘆丁對照品(2010-A0103，純度＞98%)，購于中國成都曼思特生物科技有限公司;實驗用水為蒸餾水，由實驗室自制;氫氧化鈉、硝酸鋁、亞硝酸鈉及鹽酸等均為分析純試劑。

1.2 儀器及設備UV-2102PCS型紫外-可見分光光度計，購于上海尤尼科儀器有限公司;RE-52A型旋轉蒸發儀，購于鞏義市予華儀器廠;pHS-3C型精密酸度計，購自上海雷磁儀器廠;SHZ-D(III)型循環水式真空泵，由河南鞏義市英山谷予華儀器廠提供;YJ501型超級恒溫器，由上海躍進醫療器械廠提供;電子天平，由梅特勒-托利多儀器廠提供;遠紅外快速恒溫干燥箱，購自上海躍進醫療器械廠。

2 方法

2.1 對照品溶液的制備稱取蘆丁對照品32 mg，用70%乙醇溶液溶解后，轉移至50 mL量瓶中，繼續用乙醇溶液稀釋、定容，得質量濃度為0.64 mg/mL蘆丁對照品貯備液。

2.2 標準曲線的繪制及回歸方程的建立實驗選用蘆丁為對照品，采用NaNO2-Al(NO3)3-NaOH體系吸光法［9-11］制作黃酮測定標準曲線。移取0.0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL的上述2.1項蘆丁對照品貯備液分別置于6只量瓶中，加入NaNO2溶液還原6 min，隨后加入Al(NO3)3溶液絡合，再加入NaOH溶液5 mL，用乙醇溶液稀釋、定容，搖勻、顯色10 min后，于波長為510 nm處，以試劑空白作為參比，用紫外-可見分光光度計分別測定上述溶液的吸光度值。以蘆丁質量濃度為縱坐標(C)，以吸光度值為橫坐標(A)，制作標準曲線，得回歸方程為:C=93.889A－0.360 3，相關系數r=0.999 8，曲線中黃酮質量濃度線性范圍為0～64 μg/mL。

2.3 半仿生提取

2.3.1 提取溶劑的制備根據仿生學原理，人體消化道(胃、小腸、大腸)體液酸度pH分別為2.0、7.5、8.3［12］，因此，實驗中用HCl和Ca(OH)2飽和溶液將提取溶劑pH分別調為2.0、7.5、8.3，備用。

2.3.2 樣品的處理及制備取葉下珠全草經粉碎、過篩(60目)后，稱取20.00 g于圓底燒瓶中，在一定條件先用pH 2.0的提取劑提取，冷卻后過濾，收集濾液，所得濾渣分別再用pH 7.5、8.3的提取溶劑各重復提取一次，冷卻、過濾，合并提取所得濾液，經減壓濃縮得葉下珠提取液。提取液中總黃酮按2.4項的方法測定。

2.4 黃酮的測定吸取一定量葉下珠提取液于25 mL量瓶中，按上述2.2項黃酮對照品質量濃度的測定方法依次加入相應的溶液后測定其吸光度，并計算總黃酮提取得率。

2.5 正交實驗設計在查閱文獻的基礎上，選取提取溫度、提取時間、料液比等三因素，每個因素3個水平進行實驗，選用L9(34)正交表進行實驗設計優選半仿生法提取工藝條件。實驗因素、水平安排如表1。每個實驗分別在pH 2.0、7.5、8.3的溶劑中提取一次，合并濾液后測定黃酮。

表1 正交實驗因素水平表

2.6 驗證實驗依據正交實驗結果，按2.3.2項樣品處理及制備的方法，在最優工藝條件下提取葉下珠總黃酮，平行實驗3次。

3 結果及分析

3.1 正交實驗結果及直觀分析根據實驗安排，提取葉下珠總黃酮的正交實驗結果見表2。

表2 正交實驗結果及分析表

從表2中極差R的大小可看出，在實驗考察的三個因素中，對黃酮提取得率影響的主次關系為:A(提取溫度)＞C(料液比)＞B(提取時間);通過比較各因素的不同水平的k值，可得半仿生法提取葉下珠黃酮最佳工藝為A3B1C2，即提取溫度85℃，提取時間1.5 h，料液比1∶20。

3.2 正交實驗結果的方差分析實驗的方差分析結果見表3。

表3 實驗結果方差分析表

從表3中可以看出，考察的實驗因素中，在考察的因素水平范圍內，溫度對葉下珠黃酮的提取得率的影響顯著，料液比對葉下珠黃酮的提取得率有一定的影響，時間對葉下珠黃酮的提取得率的影響不顯著。

3.3 驗證實驗結果利用正交實驗的最佳工藝條件，即提取溫度85℃，提取時間1.5 h，料液比1∶20做驗證實驗，平行3次，結果見表4。

表4 驗證實驗結果表

3次驗證實驗平均提取得率為1.505%，RSD=0.433%，結果為所有實驗中最高的。該實驗結果表明，半仿生提取法用于葉下珠總黃酮的提取，黃酮得率高，方法可靠，結果準確。

4 結論

4.1 運用半仿生法提取葉下珠總黃酮時，用pH分別為2.0、7.5、8.3的水溶液為提取溶劑各提取一次，用正交實驗考察提取溫度、提取時間和提取料液比對提取得率的影響，結果表明:在考察的因素水平范圍內，溫度對葉下珠黃酮提取得率影響顯著，時間對葉下珠黃酮提取得率影響不顯著，料液比對黃酮得率有一定的影響。各因素對黃酮提取得率的影響大小次序為:提取溫度＞料液比＞提取時間。葉下珠總黃酮的最佳提取工藝條件為:提取溫度85℃，料液比1∶20，提取時間1.5 h。用此工藝提取葉下珠黃酮提取得率較高，可達1.505%，優于文獻顯示的傳統方法提取效果［13］。

4.2 與傳統的提取方法比較，半仿生提取法模擬人體口服給藥過程，以不同pH的水溶液為提取溶劑，不使用有機溶劑，減少對環境及生產操作人員的身體傷害，對環境友好，易于實現綠色化生產，且提取得率較高，利于降低生產成本。

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［2］全國中草藥匯編編寫組.全國中草藥匯編:上冊［M］.北京:人民衛生出版社，1978:263.

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