紅曲霉誘導產生紅曲色素條件的研究

董夏蓮，王紅英，錢斯日古楞，李長清

(大連工業大學生物工程學院，遼寧大連116034)

紅曲霉(Monascns)是一種小型絲狀腐生真菌，屬真菌門，子囊菌綱，真子囊菌亞綱，曲霉科，紅曲屬［1］，廣泛存在于新鮮的牧草、泥土、橡膠及松樹根等組織中［2］。它嗜酸，特別是乳酸，耐高溫、耐乙醇，生長最適pH為3.5～5.5，生長溫度為26～42℃。它多出現在乳酸自然發酵基物中，能利用多種碳源、氮源。紅曲霉在其生長過程中產生紅曲色素，純天然，無毒無副作用。近年來，由于合成色素的安全性受到挑戰，天然色素日益受到重視［3-4］。紅曲霉在許多亞洲國家特別是東南亞被用來作為加工傳統食品的微生物。在我國的利用也有悠久的歷史，被廣泛運用于釀酒、腐乳、食醋、食品色素、中藥等方面［5］。

紅曲色素不僅可作為天然色素，而且具有明顯的脂肪酶抑制活性。因此，在降血脂保健品和減肥產品的研發中具有廣泛應用前景［6-8］。人們苦于肥胖引起的疾病，如果能夠阻止脂肪的消化吸收，對高脂肪引起的肥胖和疾病將有很大的改善。目前市場上常見的減肥藥物主要是作用于大腦，通過抑制食欲減少食品的攝入量，也有一部分是通過抑制脂肪酶活性，以減少脂肪吸收而達到減肥目的。但是，這些皆是合成類藥物，有不同程度的副作用。因此越來越多的學者將目光瞄準了天然藥物［9］。

本實驗以D-青霉胺(H-Pen)為誘導劑，使紅曲霉誘導產生大量的紅曲色素，并對紅曲色素進行分離提取，同時對誘導條件進行優化。這將對紅曲色素減肥天然保健品的研發探索一條新的道路。

1 材料與方法

1.1 材料紅曲霉Monascus購于大連旅順圓寶豆制品廠;D-青霉胺(H-Pen)，上海晶純試劑有限公司;其它試劑均為國產分析純。

1.2 培養基硝酸鈉1 g，葡萄糖2.5 g，磷酸二氫鉀0.075 g，硫酸鎂0.05 g，用50 mL蒸餾水溶解，用乳酸調節其pH為3.5，121℃滅菌20 min。

1.3 方法

1.3.1 紅曲霉的培養將紅曲霉孢子接入裝有玻璃珠的三角瓶中，30℃振蕩1 h，使孢子充分打散，取1 mL孢子懸液梯度稀釋至1×107個/mL備用。

在無菌操作條件下，向盛有50 mL培養基的250 mL三角瓶中接入1 mL 107個/mL紅曲霉孢子菌懸液，30℃、160 r/min振蕩培養12 d取出。

1.3.2 誘導產生紅曲色素將0.35 g H-Pen加入50 mL蒸餾水中充分溶解混勻，制備成0.7%的誘導劑溶液。

培養基滅菌后，在無菌條件下，向培養基中接入1 mL 107個/mL紅曲霉孢子菌懸液，其中一瓶培養基加入質量分數為0.07%誘導劑，另外一瓶不加誘導劑做空白對照，30℃、160 r/min振蕩培養12 d取出。

將培養得到的發酵液用四層紗布過濾，洗滌兩遍，擠干，再用濾紙反復壓干稱定質量，即為濕菌體生物量。

發酵液過濾后得到的菌體加入15 mL無水乙醇37℃條件下萃取0.5 h，離心取上清液，用適量無水乙醇稀釋，用分光光度計在410 nm處測定紅曲色素提取液的OD值［10］。用無水乙醇做空白對照。

1.3.2.1 誘導劑添加量對紅曲色素產生的影響在無菌條件下，對質量分數為0.7%的誘導劑進行梯度稀釋，分別配制質量分數為0.7%、0.07%、0.007%、0.000 7%、0.000 07%的誘導劑溶液。取不同質量分數的誘導劑各1 mL，分別加到培養基中，向培養基中接入1 mL 107個/mL紅曲霉孢子菌懸液，30℃、160 r/min振蕩培養12 d。取出，測定紅曲霉的濕菌體量和紅曲色素的色價。無誘導劑的做空白參照。

1.3.2.2 pH值對誘導產生紅曲色素的影響用乳酸為調節劑，分別配置pH為2.8、3.8、4.8、5.8、6.8的培養基。滅菌后，在無菌條件下各加質量分數為0.000 7%的誘導劑，接入1 mL 107個/mL的紅曲霉孢子菌懸液。在30℃、160 r/min振蕩培養12 d。取出，測定紅曲霉的濕菌體量和紅曲色素的色價

1.3.2.3 培養溫度對誘導產生紅曲色素的影響配制培養基，用乳酸調節pH到3.5，在無菌條件下，向培養基中加入質量分數為0.000 7%的誘導劑，接入1 mL 107個/mL紅曲霉孢子菌懸液，培養溫度分別為26、28、30、32、35℃，160 r/min振蕩培養12 d。取出，測定紅曲霉的濕菌體量和紅曲色素的色價。

1.3.2.4 培養時間對誘導產生紅曲色素的影響配制培養基，用乳酸調節pH到3.5，在無菌條件下，所有培養基中加入質量分數為0.000 7%的誘導劑，接入1 mL 107個/mL紅曲霉孢子菌懸液，培養溫度為30℃，160 r/min振蕩培養，分別在培養8、10、12、14、16d。取出，測定紅曲霉的濕菌體量和紅曲色素的色價。

1.3.2.5 裝瓶量對誘導產生紅曲色素的影響配制培養基，用乳酸調節pH到3.5，分別取50、100、150 mL培養基裝入250 mL三角瓶中，在無菌條件下，所有培養基中加入質量分數為0.000 7%的誘導劑，接入1 mL 107個/mL紅曲霉孢子菌懸液，30℃、160 r/min振蕩培養12 d。取出，測定紅曲霉的濕菌體量和紅曲色素的色價。

2 結果

2.1 添加誘導劑對紅曲色素產生的影響配制兩瓶培養基，一瓶加入質量分數為0.07%的誘導劑，另外一瓶不加誘導劑做空白參照，兩瓶培養基中均接入1 mL 107個/mL紅曲霉孢子菌懸液，30℃、160 r/min振蕩培養12 d，結果見圖1。

圖1 誘導劑對菌體生長的影響Fig.1 Inducer effects on cell growth

由圖可見，通過對有誘導劑與無誘導劑的紅曲霉的菌質量及胞內紅色素的吸光值的對比，誘導劑促進紅曲霉產生紅曲色素，同時對菌體生長有明顯的促進作用。

2.2 誘導產生紅曲色素

2.2.1 誘導劑添加量對紅曲色素產生的影響分別向培養基中加入質量分數為0.7～0.000 07%的誘導劑，培養后，得到菌體質量及胞內色素的色價。沒添加誘導劑的做空白對照，結果見圖2。

圖2 誘導劑添加量的選擇Fig.2 Choice of the amount of inducer added

由圖可見，誘導劑添加量為0.000 7%誘導產生的紅曲色素色價最高，菌體質量相對較大。綜合考慮菌體的色價、菌體生長量，確定誘導劑加量為0.000 7%是最佳誘導劑加量。

2.2.2 誘導pH值的確定用乳酸為調節劑，配制pH為2.8～6.8的培養基。培養后，得到菌體質量及胞內色素的色價，結果見圖3。

圖3 最佳培養pH的確定Fig.3 Determination of optimal culture pH

由圖可見，pH值為3.8的時候，誘導產生的紅曲霉菌量最大，紅曲色素色價最高。確定pH值3.8為最佳誘導pH。

2.2.3 誘導溫度的確定將紅曲霉分別在26～35℃條件下震蕩培養。培養后，得到菌體重量及胞內色素的色價，結果見圖4。

圖4 最佳培養溫度的確定Fig.4 Determination of optimal culture temperature

由圖可見，培養溫度為26、28、30、32℃時，紅曲霉的菌體量、色價依次明顯遞增，32℃到35℃紅曲霉的菌體量、色價沒有明顯變化。綜合考慮菌體的色價、菌體生長量及最低耗能，確定32℃為誘導紅曲霉產生紅色素的最佳溫度。

2.2.4 培養時間的確定其它培養條件不變的情況下，將紅曲霉分別培養6～14 d，得到菌體質量及胞內色素的色價，結果見圖5。

由圖可見，培養時間為6、8、10、12 d，紅曲霉的菌體量、色價依次明顯遞增，12 d到14 d紅曲霉的菌體量、色價沒有明顯變化。綜合考慮菌體的色價、菌體生長量及最低耗能，確定12 d為誘導紅曲霉產生紅色素的最佳培養時間。

圖5 最佳培養時間的確定Fig.5 Determination of optimal culture time

2.2.5 裝液量的優化為了考察通風量對紅曲霉產色素的影響，同時又考慮到最低的動力消耗而采用搖瓶不同裝液量對紅曲霉產色素的影響［11］。結果見表1。

表1 不同裝液量對紅曲霉產紅曲色素的影響Tab.1 Effects of different volumes in flask liquid on pigment of Monascus

3 討論

H-Pen誘導紅曲霉產生紅曲色素效果明顯，其最佳條件為，誘導劑添加量為0.000 7%，培養pH條件為3.8，溫度為30℃，培養時間為12 d，最佳每瓶裝液量50 mL。

紅曲色素是目前唯一允許在食品中使用的天然真菌色素，紅曲色素作為食品添加劑時除了可提高食品的色澤還可抑制體內脂肪酶的活力，達到降低脂肪吸收的效果，同時，通過抑制有毒物質(桔霉素)的合成［12］，提高紅曲色素的產量，提高其色價，確定出誘導條件和對脂肪酶抑制力的關系，提高紅曲色素的穩定性以后，其產品將會有更廣闊的前景。

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