黏菌素HPLC分析方法的研究進(jìn)展

陳 曦 王觀悅 徐宗香 安麗娜 李 陽

（黑龍江省獸醫(yī)科學(xué)研究所，齊齊哈爾 161006）

黏菌素HPLC分析方法的研究進(jìn)展

陳 曦 王觀悅 徐宗香 安麗娜 李 陽

（黑龍江省獸醫(yī)科學(xué)研究所，齊齊哈爾 161006）

黏菌素是一類對(duì)革蘭氏陰性致病菌具有很強(qiáng)體外抗性的多肽抗生素，能治療由多重耐藥性病菌引起的多種疾病。黏菌素的分析方法主要有微生物學(xué)方法、高效液相色譜法（HPLC）、酶聯(lián)免疫分析法（ELISA）、毛細(xì)管電泳法（CE）及薄層層析法（TLC）等。本文主要綜述黏菌素的高效液相色譜（HPLC）分析方法的研究進(jìn)展。

多黏菌素 分析方法 高效液相色譜法

黏菌素（colistin）是1947年從多黏菌素B.polymyxa 或產(chǎn)氣孢子桿菌B.aerobaillus 的培養(yǎng)濾液中得到的一種堿性多肽類抗生素。黏菌素又稱為多黏菌素E，黏桿菌素，克利斯汀和抗敵素，它是一種至少含有30多種不同成分的混合物，主要為黏菌素A和黏菌素B[1]。黏菌素是一種抗菌作用較強(qiáng)、毒性較低的多肽類抗生素，它對(duì)革蘭陰性菌具有強(qiáng)大抗菌作用，并能中和革蘭陰性菌產(chǎn)生的內(nèi)毒素，且具有殘留低，不易產(chǎn)生耐藥性等優(yōu)點(diǎn)，因此，黏菌素是最有發(fā)展前途的抗菌素之一。

黏菌素是由七環(huán)和末端的三肽組成的十肽菌素，尾部的脂肪酸通過酰胺鍵連接到末端的三肽，七環(huán)有親水端和疏水端，三肽只有親水端。帶有正電荷的氨基酸和尾部的脂肪酸使黏菌素具有兼容性，可溶于水，也可溶于脂類[2]。黏菌素為白色結(jié)晶或結(jié)晶性粉末，干燥狀態(tài)下可長(zhǎng)期保持穩(wěn)定。臨床上主要是用其硫酸鹽，硫酸黏菌素為白色或微黃色粉末，微臭或幾乎無臭，味苦，有吸濕性，易容于水和含水甲醇。英國(guó)藥典解釋為不溶于乙醚、丙酮和氯仿，美國(guó)藥典解釋為微溶于甲醇，不溶于乙醚和氯仿。硫酸黏菌素的水溶液呈左旋性，性能穩(wěn)定，可在 100 ℃下保存9 d，在 40℃下保存 60 d，活力不變。在 pH 值為3～7.5 較穩(wěn)定，在強(qiáng)酸性及堿性溶液中易分解，與茚三酮及雙縮脲呈陽性反應(yīng)。耐熱，消化道不易吸收，排泄迅速，毒性小，無副作用，不易產(chǎn)生耐藥菌株[3]。硫酸黏菌素結(jié)構(gòu)中不存在發(fā)色團(tuán)，需衍生化后能用LC法測(cè)定。

目前國(guó)內(nèi)對(duì)硫酸黏菌素的研究主要集中在應(yīng)用以及動(dòng)物性食品中殘留檢測(cè)方法上，對(duì)其毒性及藥物代謝方面也有一些初步研究。黏菌素分析方法主要有微生物學(xué)方法、高效液相色譜法（HPLC）、酶聯(lián)免疫分析法（ELISA）、毛細(xì)管電泳法（CE）及薄層層析法（TLC）等。Leroy等[4]（1989）運(yùn)用微生物學(xué)方法和HPLC法檢測(cè)了小牛體內(nèi)黏菌素的含量，結(jié)果顯示微生物學(xué)方法缺乏敏感性，選擇性和檢測(cè)時(shí)間偏長(zhǎng)（21h），而HPLC法非常靈敏，能夠分離黏菌素各組分。由于免疫原準(zhǔn)備工作很復(fù)雜，所以很少有研究是應(yīng)用酶聯(lián)免疫分析法進(jìn)行黏菌素的殘留檢測(cè)。

微生物學(xué)方法和酶聯(lián)免疫分析法均不能分離黏菌素各組分，而薄層層析法（TLC）、毛細(xì)管電泳（CE）和高效液相色譜法（HPLC）能分離黏菌素（堿和硫酸鹽）A和B，但是不能與甲烷磺酸黏菌素區(qū)別開來，所以關(guān)于黏菌素的體內(nèi)分析方法國(guó)內(nèi)還存在著一些缺陷。

高效液相色譜法自上世紀(jì)70年代初應(yīng)用于分析黏菌素以來，主要用于對(duì)黏菌素所含各組分的分離。Shigeru Terabe等[5]（1979）、T.J.Whall[6]（1980）、Cindy Govaerts[7]（2002）等相繼對(duì)此進(jìn)行了報(bào)道，分離出的成分多達(dá)十三種。也有資料報(bào)道用HPLC法測(cè)定硫酸粘桿菌素的含量，其檢測(cè)限較高，最低為0.5μg/ml。

黏菌素主成分結(jié)構(gòu)中具有多個(gè)伯胺基團(tuán)，能與C18填料中殘留的硅醇基發(fā)生強(qiáng)烈相互作用，導(dǎo)致峰拖尾或峰形異常，所以流動(dòng)相一般呈酸性，需含有高濃度的鹽或隱蔽劑以抑制硅醇基的吸附活性。Ikai[8]的研究結(jié)果表明：大孔徑填料和不含硅醇基的苯基填料對(duì)分離效果較好，峰形尖銳。大孔徑填料可能有利于高分子量黏菌素的自由擴(kuò)散，傳質(zhì)阻力較小。

解慶繽等[9]（1988）側(cè)洗脫液為乙晴，磷酸/甲酸鹽和乙酸鹽緩沖液，C18柱以23%的乙晴磷酸鹽緩沖液為流動(dòng)相，紫外檢側(cè)，在1.0～100.0μg范圍內(nèi)濃度呈良好的線性關(guān)系。檢測(cè)限為5×10-7g，A、B的回收率分別為98.O%和97.1%。

Decolin等[10]（1997）測(cè)定牛組織（肌肉、肝臟、脂肪）及牛奶中粘桿菌素的殘留，10%（w/v）三氯乙酸為蛋白沉淀劑，在C18柱上固相純化，柱前洗脫液為乙晴：磷酸鹽緩沖液（pH7.0）65：35（V/V），分析柱洗脫液為68：32（V/V），熒光檢測(cè)，激發(fā)波長(zhǎng)及發(fā)射波長(zhǎng)分別為340nm和440nm。黏菌素A、B保留時(shí)間分別為14min、18min。黏菌素結(jié)構(gòu)用HPLC法聯(lián)合質(zhì)譜進(jìn)行分析。結(jié)果表明：在10～500mg/L（牛奶）、50～1000mg/kg（肌肉、脂肪）、100～1000mg/kg（腎臟、肝臟）范圍內(nèi)的標(biāo)準(zhǔn)曲線相關(guān)系數(shù)大于0.990。在25 mg/L（牛奶）、100 mg/kg（組織）標(biāo)準(zhǔn)濃度相對(duì)偏差值低于10%（6個(gè)重復(fù)），回收率高于60%。

選擇適當(dāng)檢測(cè)波長(zhǎng)對(duì)成功建立測(cè)定方法相當(dāng)關(guān)鍵，HPLC/UVD（200～254nm）由于組織中干擾黏菌素檢測(cè)的物質(zhì)較多，其靈敏度和選擇性較難滿足黏菌素殘留分析要求，HPLC法分析中的進(jìn)行衍生化反應(yīng)可以提高檢測(cè)分析的靈敏度和選擇性。在室溫堿性條件下（pHl0.0）和2-疏基乙醇存在下，黏菌素結(jié)構(gòu)中伯胺基團(tuán)迅速與鄰二苯甲醉（OPA）發(fā)生縮合反應(yīng)，生成具有強(qiáng)烈熒光，較穩(wěn)定的l-S-烷基-2-N-烷基異吲哚衍生物。

黏菌素呈弱堿性，易溶于水，在酸性溶液中較穩(wěn)定.Ikai[8]（1995）報(bào)道黏菌素的C18凈化方法，平衡：甲醇，水；洗滌：水，15%乙晴（含0.1%TFA）；洗脫：乙晴—0.017mol/LTFA（20+80），上述C18洗滌液對(duì)除去雜質(zhì)很有效，回收率為64%，檢測(cè)限為0.2μg/g，該方法較低的回收率可能與待測(cè)物吸附和提取過程中基質(zhì)的共沉淀有關(guān)。

Decolin等[10]（1997）建立的黏菌素衍生化LC/FLD方法中，組織樣品（牛肌肉，肝，腎，脂肪）的提取溶劑為甲醇-10%TCA（50+50），提取乳汁則僅使用10%TCA，提取液經(jīng)甲醇—0.01mol/LHCL（55+45）洗脫，OPA試劑衍生化，在線Cl8柱凈化后測(cè)定，回收率62%～78%，檢測(cè)限為0.002（乳）～0.02（組織）μg/g.黏菌素與組織結(jié)合較強(qiáng)，提取液中加入TCA可沉淀蛋白質(zhì)和解離藥物，固體樣本需同時(shí)加入甲醇以改善提取效率。Li等[11]（2001）運(yùn)用一種簡(jiǎn)便、快速、靈敏的HPLC方法檢測(cè)血漿中的黏菌素（堿或硫酸鹽），即先運(yùn)用熒光性的芴甲氧羰酰氯（FMOCCl）進(jìn)行柱后衍生化，再采用反相高效液相色譜法（RP-HPLC）分離分析血漿中的黏菌素。通過此種方法，在檢測(cè)黏菌素的過程中就能排除通過此種方法，在檢測(cè)黏菌素的過程中就能排除甲烷磺酸衍生物的干擾，并且與運(yùn)用鄰苯二甲醛（OPA）進(jìn)行衍生化不同的是這些添加了FMOC的衍生物在室溫下可保持3d，而且此法能分離黏菌素A和黏菌素B。

高效液相色譜法具有很高的特異性、靈敏度以及較快的檢測(cè)速度，但由于硫酸粘桿菌素組成的多樣性及成分的不確定性，使得應(yīng)用高效液相色譜法對(duì)其進(jìn)行殘留分析還有待進(jìn)一步的研究。

[1] McNutt SH，Purwin P，Murray C. Vulvoraginitis in swine [J]. J Am Vet Med Assoc，1928，73：484

[2] Orwa J A，Van Gerven A，Roets E，et al.Development and validation of a liquid chromatography method for analysis of colistin sulphate [J].Chromatographia，2000（51）：433-436

[3] Falagas M E，Kasiakou S K.Colistin：the revival of polymyxins for the management of multidrug-resistant gram- negative bacterial infections[J].ClinInfect Dis，2005（40）：33-41

[4] 朱模忠.獸藥手冊(cè)[M].北京：化工出版社，2002.84-85

[5] Leroy P，Decolin D，Nicolas S，et al. Residue Determination of Two Co-adm in istered Antibacterial Agents-cephalexin and Colistin in Calf Tissues Using High-performance Liquid Chromatography and Microbiological Methods [J]. JPharm Biomed Anal，1989，7（12）：1837

[6] Shigeru Terabe，Ryusei Konaka and Jurichi shoji，Seperation of polymaxinsw with an analytical high-performance liqulid chromatography system by using dispalcement chromatography，Journal of Chromatography，215（1981）：295-301

[7] T.J.Whall，High-performance Liqulid Chromatography of polymyxin B sulfate and colitin sulfate J.Chromatog，208（1981）：118-123

[8] Cindy GovaortS，Jef ROzenski，Jennifer Orwa Masss sptrometric fragmentation of cyclic peptides beloing to the polymyxin and colistin antibiotics studies by ion-trap and quadrupole/orthogonal-acceleation time of flight technology，Repid Commun. Mass Spectrom 2002（16）：823-833

[9] Ikai Y.Chemical anaylysis of peptide antibiotica In：Oka H，et al.Ed.Chemical analysis for antibiotics used in agriculture.Alington：AOAC International，1995，407

[10] 解慶鎮(zhèn)，顧吉林，硫酸粘桿菌素E的高效液相色譜測(cè)定.抗生素，1988（13）1：36-40

[11] Decolin D，Leroy P，Nicolas A，et al. Hyphenated Liquid ChromatographicMethod for the Determination of Colistin Residues in Bovine Tissues [J]. J Chromatogr Sci 1997，35（12）：557

[12] Li J，MilneRW，Nation RL，etal. A Simple Method for the Assay of Colistin in Human Plasma，Usin gPre-column Derivatization with 9-fluoreny ln ethyl Chloroformate in Solid-phase Extraction Cartridges and Reversed-phase High-performance Liquid Chromatograph[J]. J ChromatogrB Biomed SciAppl 2001，761（2）：167