豬瘟、高致病性豬藍耳病和口蹄疫疫苗免疫試驗報告

周春炎 周昌龍 關偉偉

（江蘇省如皋市畜牧獸醫站，如皋 226500）

豬瘟、高致病性豬藍耳病和口蹄疫疫苗免疫試驗報告

周春炎 周昌龍 關偉偉

（江蘇省如皋市畜牧獸醫站，如皋 226500）

豬瘟俗稱“爛腸瘟”，是由黃病毒科豬瘟病毒屬的豬瘟病毒引起的一種急性、發熱、接觸性傳染的傳染病。具有高度傳染性和致死性。高致病性豬藍耳病是由豬繁殖與呼吸綜合征（俗稱藍耳病）病毒變異引起的一種急性高致死性疫病。仔豬發病率可達100%、死亡率可達50%以上，母豬流產率可達30%以上，育肥豬可發病死亡。這2個傳染病的臨床癥狀、病理變化有相似之處，不易區分。為尋求最佳免疫方案，本實驗研究采用2病疫苗的不同劑量、不同疫苗品種、不同疫苗組合等進行實驗，同時，進行免疫抗體檢測。

1 材料和方法

1.1 實驗材料

1.1.1 疫苗

1.1.1.1 豬口蹄疫O型滅活疫苗（O/MYA98/BY/2010株）（WA）批號：H110206J 規格：100ml/瓶 廠家：××生物科技股份有限公司；口蹄疫O型滅活疫苗（OZK/93株+OR/80株）（WB）批號：0132059 規格：50 ml/瓶 廠家：××生物藥品有限公司。

1.1.1.2 豬瘟活疫苗（細胞源）（CSFV）批號：101005 規格：20頭份/瓶 廠家：××生物股份有限公司。

1.1.1.3 豬藍耳活疫苗批號：1011099-2規格：20頭份/瓶 廠家：××股份有限公司。

1.1.2 主要實驗儀器和試劑 采血器，注射器，酶標儀，生化培養箱，微量加樣器等，O型口蹄疫抗體液相阻斷ELISA檢測試劑盒，豬瘟病毒抗體檢測試劑盒，ELISA豬繁殖和呼吸綜合征抗體檢測試劑盒。

1.1.3 實驗豬 如皋某生豬養殖場。

1.2 方法

1.2.1 免疫程序 各實驗組于19日齡免疫豬藍耳活疫苗2頭份，具體免疫情況詳見表1。

1.2.2 血樣采集 5組實驗豬，分別在27、57、87、118、149日齡采集血樣，每次4 ml。27、57日齡免疫前采血樣。

1.2.3 抗體免疫效果檢測 采用ELISA的方法進行免疫效果監測。豬瘟病毒抗體檢測試劑盒廠家：北京愛德士元亨生物科技有限公司，批號：43220-V731。LSI豬繁殖和呼吸綜合征抗體檢測試劑盒廠家：北京天之泰生物科技有限公司 批號：5-VETPRA-012。

具體操作如下：

1.2.3.1 豬瘟抗體檢測

1.2.3.1.1 加樣 每個檢測孔分別加入50 μl樣品稀釋液，分別將50 μl陽性對照和陰性對照加入到相應的對照孔中，注意不同對照的吸頭需要更換，分別將50 μl被檢樣品加入到剩余的檢測孔中，注意更換吸頭；

1.2.3.1.2 孵育 將微量反應板用振蕩器振蕩，混勻反應板中的溶液，與室溫下（18℃～25℃）孵育2 h，注意封板或置于濕盒中，避免液體揮發。

1.2.3.1.3 用300 μl洗滌液連續洗ELISA板3次，在吸水紙上甩干。

1.2.3.1.4 加入100 μl辣根過氧化物酶結合物，封板，室溫溫育30 min。

1.2.3.1.5 同上。洗板3次，甩干。每孔加100 μl底物溶液，避光、室溫下溫育10 min。

1.2.3.1.6 每孔加入終止液100 μl，混勻；立即置波長450 nm的酶標儀，讀取OD值。

1.2.3.2 豬藍耳病抗體檢測

1.2.3.2.1 用樣品稀釋液將樣品進行200倍稀釋，先吸取5 μl的樣品加入95 μl樣品稀釋液中，混勻，再吸取5 μl稀釋了20倍的液體加入ELISA反應板孔，再加入45 μl的樣品稀釋液；

表1 各實驗組免疫情況一覽表

1.2.3.2.2 分別將50 μl陽性對照、陰性對照、及200倍稀釋的樣品在反應板孔。

1.2.3.2.3 蓋上膜，在37℃作用60 min。

1.2.3.2.4 去膜，用300 μl洗滌液連續洗ELISA板3次，在吸水紙上甩干。

1.2.3.2.5 加入50 μl酶標抗體，封板，37℃溫育60 min。

1.2.3.2.7 同上洗板3次，甩干。每孔加50 μl底物溶液，避光、20℃～25℃下溫育10 min。

1.2.3.2.8 每孔加入終止液50 μl，混勻；立即置波長450 nm的酶標儀，讀取OD值。

2 結果

2.1 臨床觀察

開展豬藍耳病、豬瘟、口蹄疫等疫苗免疫注射后，1周內臨床觀察全部實驗豬均無疫苗反應出現。后期出現5頭生豬死亡，通過養殖場技術人員發病前的觀察及死亡后解剖診斷為腸炎和胸膜肺炎，與疫苗無關。

2.2 抗體檢測

2.2.1 豬瘟抗體

豬瘟陰陽性的判斷：豬瘟陰陽性于OD值成反比。大于臨界OD值判為陰性，且隨著OD值得升高，陰性抗體滴度越低；小于臨界OD值判為陽性，且隨著OD值得降低，陽性抗體滴度越高。

從表3可見，實驗組內的豬群在經豬瘟免疫后抗體陽性率均有不同程度上升，對比5個組的抗體陽性率可見，C組的陽性率呈直線上升，到第4次所采樣中陽性率達100%。A、B、D、E4個組的與其比較，在前3次采樣中除B組陽性率高于C組外，其他均低于C組，到第4、第5次采樣后陽性率全都低于C組。其中，D組第1次采樣所測抗體為母源抗體陽性率達90.91%，在進行1次豬瘟免疫后在第2次免疫前采樣所測抗體陽性率降為0%，再見過2次免疫后抗體陽性率才有所上升。總之，C組豬瘟免疫方案從免疫效果看出，可值得推廣；母源抗體高的個體在免疫后會產生一些中和，促使抗體下降，保護率下降，這就要求在疫苗免疫之前做好抗體檢測對后期疫苗的防疫有著直接的指導意義。

從圖4可以看出，實驗A組豬瘟第1次到第2次采樣OD值有所升高，是由于母源抗體因素，產生中和，導致抗體滴度降低；在第2次免疫之后，到第3次、第4采樣后所測OD值大部分均呈下降趨勢，到第5次采樣所測OD值大部分呈反彈趨勢，表示抗體滴度在降低，保護率有所下降。

由圖5可以看出，實驗C組豬瘟第1次到第2次采樣OD值下降，明顯可見所測母源抗體OD值比較高，即抗體滴度低，與免疫抗原產生的反應小，隨著疫苗在體內刺激機體產生抗體到第2～第4次采樣后所測OD值呈下降，到第5次采樣所測OD值成上升趨勢，是由于免疫后隨著時間的推移，機體內的抗體滴度有所下降。

圖2 豬瘟純陽性率

圖3 豬瘟抗體OD值

圖4 C組豬瘟抗體OD值

2.2.2 高致病性藍耳病抗體檢測

本次實驗豬在19日齡全部免疫2頭份豬藍耳病活疫苗1次，在27、57、87、118、149日齡采血樣進行抗體檢測。該檢測利用特異的PRRS被包被在96孔板上，在反應過程中，檢測樣本被加入反應孔中，樣本中的特異性抗體會與孔中包被的特異性抗原反應，在洗板的過程中不會被清洗掉，當添加酶標復合物時，這些酶標復合物就會與豬的抗體發生反應。沒有結合的酶標復合物在洗板的過程中被清洗。在加入對氧化酶敏感的可以顯色底物。顯色的顏色深淺與樣本所含PRRS的抗體濃度成正比。抗體陰陽性界定以臨界值為界，低于該臨界值為陽性，低于臨界值為陰性，個體抗體滴度與所測OD值成正比。

從圖6可以看出，C、D組PRRS抗體滴度隨著時間的推移到第4次采樣所測OD值均呈上升趨勢，到第5次部分呈下降，分析由于免疫后時間過長，抗體有所下降。可見PRRS的免疫超過一定時間必須加強免疫1次，每次間隔時間大約為4個月左右。

本試驗報告基于2011年江蘇省農業三項工程，項目編號：sx（2011）181。

項目名稱：生豬口蹄疫O型疫苗（O/MAY98/BY/2010株）免疫試驗與推廣。