垂體催乳素腺瘤細胞體外培養(yǎng)的實驗研究

高 普 王 洪 史彥芳 王明棟 賈潮微 陳 研 劉杏棉

（1 河北大學附屬醫(yī)院神經(jīng)外科，河北 保定 071000；2 河北曲陽縣人民醫(yī)院，河北 曲陽 073100）

垂體腺瘤為來源于垂體前葉的良性腫瘤。隨著影像及內分泌診斷技術的提高，其發(fā)病率有日漸增多的趨勢。催乳素腺瘤是其中最常見的一種分泌性垂體腺瘤，約占垂體瘤的30%～40%。其中女性患者發(fā)病率比男性患者多5倍。2/3女性患者是微腺瘤，多在20～40歲，以高PRL血癥的溢乳-閉經(jīng)-不育三聯(lián)征就診。男性患者90%以上是大腺瘤，多在40～55歲間，因腫瘤壓迫鞍區(qū)組織就診，多表現(xiàn)為性欲減退，陽痿、體重增加、毛發(fā)稀少等。目前垂體催乳素瘤的發(fā)病機制仍不明確。因此我們對PRL瘤進行體外細胞培養(yǎng)，從而為研究PRL瘤的病因、發(fā)病機制，為診斷和治療PRL瘤提供實驗基礎。

1 材料與方法

1.1 標本來源

選取河北大學醫(yī)學院附屬醫(yī)院神經(jīng)外科2009年10月至2011年10月住院經(jīng)手術切除治療的PRL瘤病例16例，其中男性6例，女性10例，年齡30～65歲（平均38.5歲），術前血清PRL水平檢測及術后免疫組化染色均證實垂體PRL腺瘤。PRL瘤離體后即刻無菌取材，裝入含Hanks培養(yǎng)液的無菌試管中。取腫瘤時盡量取生長活躍的部位，盡量去除正常組織。

1.2 主要試劑

Hanks液和含雙抗的PRMI-1640培養(yǎng)液購自Beijing solarbio Science&Technology Co.Ltd。新生牛血清購自杭州四季青生物工程材料有限公司。

1.3 培養(yǎng)過程

①取所須己消毒的培養(yǎng)用品置于凈化工作臺面，紫外線消毒20min。開始工作前先洗手，75%酒精擦試手；②在無菌條件下，選取手術切除的垂體PRL腺瘤組織，置于小平皿中，用Hanks反復沖洗2～3次，去除血液等雜質，用已消毒的眼科剪將垂體瘤剪碎；③用吸管將其轉入含胎牛血清的PRMI-1640培養(yǎng)基中，在室溫下加入0.25%胰酶消化酶消化約15min。5min搖動一次，以利于充分消化，腫瘤細胞分離；④在消化過程中見消化液混濁時，可吸出少許消化液在倒置顯微鏡下觀察，如組織已分散成細胞團或單個細胞，立即加入PRMI-1640終止消化；⑤每例標本按所取的的多少將細胞等分至1～3個細胞培養(yǎng)皿中；⑥采用懸浮細胞培養(yǎng)法，定時觀察垂體腺瘤細胞的生長情況，定期換液，換下的培養(yǎng)液置于-20℃冰箱中保存，待進行激素水平測定。

1.4 統(tǒng)計學方法：

PRL實測值變化進行統(tǒng)計學分析，進行多個樣本均數(shù)間比較。用SPSS16.0軟件進行處理。

2 結 果

2.1 培養(yǎng)的PRL瘤細胞的特征 倒置相差顯微鏡下觀察，原代培養(yǎng)的PRL腺瘤細胞呈橢圓形或梭形，24h后有部分PRL瘤開始半貼壁生長，大部分呈懸浮生長。于培養(yǎng)的約第10天開始，成纖維細胞數(shù)量開始增多，并逐漸取代PRL瘤細胞。

2.2 PRL瘤細胞功能測定：換下的培養(yǎng)液采用放射免疫方法檢測。各例PRL腺瘤培養(yǎng)細胞PRL分泌量第1～5天逐漸增加，第6～8天達到高峰。測定結果顯示培養(yǎng)的PRL瘤細胞在第7天功能狀態(tài)最佳。免疫組織化學染色法檢測培養(yǎng)細胞泌乳素（PRL）的表達，培養(yǎng)的PRL瘤細胞呈PRL陽性表達。

3 討 論

垂體腺瘤是一種生長緩慢的顱內腫瘤，發(fā)病率約1/10萬人，占須內腫瘤的10%。近十年來，垂體腫瘤的臨床和基礎研究隨著科技的發(fā)展更加深入和迅速。放射免疫，免疫組化和各種內分泌激素及其的興奮/抑制實驗的應用，以及CT、MRI等影像學檢查的進步，使垂體腫瘤的診斷準確性較過去以視野、視力的改變、明顯內分泌癥狀和X線片上蝶鞍骨質的變化等診斷標準前進了一個時代。又由于分子生物學的迅速發(fā)展，使人們對垂體腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及病理生理的認識不斷深化，從而為臨床診斷、治療開辟了廣闊的前景。

PRL腺瘤是垂體腺瘤中的一種最常見的類型，約占垂體瘤的30%～40%，它的治療目前有三種方法：包括藥物控制、手術切除和放射治療。具體到每個患者，則要依據(jù)具體情況綜合考慮何種治療方法[1]。據(jù)文獻報道[2,3]，垂體腺瘤的惡性程度大多數(shù)不高，且其培養(yǎng)的細胞不容易貼壁，只有極少數(shù)能夠形成細胞系并傳代培養(yǎng)，因此其培養(yǎng)較其他腫瘤困難。PRL腺瘤細胞的貼壁較生長激素（GH）腺瘤貼壁更困難，多呈懸浮生長[4,5]。PRL腺瘤細胞的生長伴隨著成纖維細胞的成長，尤其培養(yǎng)的時間延長，成纖維細胞常與PRL腺瘤細胞同時混雜生長，時間越長，成纖維細胞生長越旺盛。因此排除成纖維細胞，得到純化的PRL腺瘤細胞成為其中最關鍵的環(huán)節(jié)。成纖維細胞的生長狀態(tài)與PRL腺瘤不同，多呈貼壁生長，因此我們采用懸浮細胞培養(yǎng)方式，這樣就排除了成纖維細胞的干擾，而且有利于其生長過程中對其分泌的激素進行測定。

正常垂體激素的分泌是在下丘腦分泌的組釋放激素和抑制激素雙重調控下進行的，而且促釋放激素占優(yōu)勢，因此脫離了下丘腦的控制、體外培養(yǎng)的正常垂體細胞激素分泌量隨時間延長迅速下降。我們通過對PRL腺瘤細胞培養(yǎng)，并測定其激素分泌的特征發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)的PRL瘤細胞在第7天功能狀態(tài)最佳。通過本次試驗研究，可以為以后治療PRL腺瘤提供良好的試驗基礎，可以通過干預垂體腺瘤細胞，觀察PRL腺瘤細胞的生長及激素分泌特征，為研究PRL腺瘤的發(fā)病機制、藥物治療及預后具有重要意義。

[1]趙繼宗,周良輔,周定標,等.神經(jīng)外科學[M].北京：人民衛(wèi)生出版社,2007：405-419.

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