腹瀉仔貉檢出攜帶耶爾森菌HPI毒力島的大腸桿菌＊

張艷英，史秋梅，房 海，陳翠珍，劉亞君，楊月琳

腹瀉仔貉檢出攜帶耶爾森菌HPI毒力島的大腸桿菌＊

張艷英，史秋梅，房 海，陳翠珍，劉亞君，楊月琳

目的為了解大腸桿菌引起仔貉腹瀉的機理，進行了小腸結腸炎耶爾森菌HPI毒力島基因的檢測，并對其菌株作毒力試驗。方法用PCR擴增法檢測毒力島基因irp2和fyua，小鼠腹腔注射檢測菌株毒力。結果從3個貉場腹瀉病死貉臟器以及糞便中分離出血清型分別為O23和O20的大腸桿菌，對兩血清型大腸桿菌進行毒力島檢測，均檢出攜帶小腸結腸炎耶爾森菌HPI毒力島基因irp2和fyu A。2個血清型O23、O20大腸桿菌均分別使小鼠發病死亡。結論仔貉腹瀉是由攜帶小腸結腸炎耶爾森菌HPI毒力島基因irp2和fyua的大腸桿菌引起，該菌對仔貉的健康具有潛在的威脅。

腹瀉；毒力島基因irp2和fyua；小腸結腸炎耶爾森菌；仔貉

毒力島（pathogenicity island）是細菌染色體上編碼毒力基因簇，最早發現于耶爾森菌屬，因與該屬菌的小鼠致死表型密切相關，故被命名為耶爾森氏菌強毒力島（HPI）［1－3］。目前，已在沙門菌、志賀菌、O139霍亂弧菌、幽門螺桿菌、泌尿道致病性大腸桿菌等細菌也發現具有毒力島存在［4－6］，毒力島具有穩定性和不穩定性及潛在的可移動成份，毒力島和新病原菌的產生有著密切聯系［4－5］。國內外研究表明，HPI可在耶爾森氏菌和大腸桿菌之間水平傳播［7－9］，與致病性大腸桿菌的毒力進化密切相關。HPI約102 kb，由許多功能相關的基因組成，其中irp2、irp1、fyua基因是HPI核心區的主要結構基因［10］，irp2可作 為 HPI的 檢 測 標 志［11－12］。1998 年Schubert等［13］報道，在93%腸黏附性大腸桿菌（Enteroadherent E．coli，EAEC）、5%的腸致病性大腸桿菌（Enteropathognic E．coli，EPEC）和腸產毒性大腸桿菌 （Enterotoxingenic E．coli，ETEC）、20%的腸侵襲性大腸桿菌（Enteroinvasive E．coli，EIEC）中具有小腸結腸炎耶爾森菌HPI毒力島的irp2基因等。為了解大腸桿菌引起仔貉腹瀉的機理，進行了小腸結腸炎耶爾森菌HPI毒力島基因的檢測，并對其菌株做毒力試驗。

1 材料與方法

1．1 材料

1．1．1 供試菌株 2011年6－8月份，秦皇島市區各縣養貉場的烏蘇里仔貉流行1種腹瀉，僅昌黎縣各貉場發病率35%（35場／100場），貉場內仔貉發病率31%～40%（155只／500只～200只／500只），有的仔貉腹瀉后死亡。我們對來自3個貉場死亡的仔貉以及腹瀉糞便標本進行了檢測，從病死仔貉臟器、小腸、腹瀉糞便中分離的細菌，編號為H1、H2。1．1．2 序列比對參考菌株 E．coli APEC O1收錄號CP000468．1，E．coli O7收錄號 CP003034．1，E．coli O26：H11收錄號 AP010953．1，E．coli O42收錄號 FN554766．1 及 E．coli O83：H1 收 錄 號CP001855．1。

1．1．3 主要試劑 樹脂型TM基因組DNA提取試劑盒（北京賽百盛基因技術有限公司），Dream TapTMGreen PCR Master Mix 2×（Fermentas公司），DNA Maker（東盛生物有限公司）；毒力島基因引物（上海生工生物工程技術有限公司合成），大腸桿菌O因子血清（中國獸醫藥品監察所，有效期2013年10月），麥糠凱培養基，葡萄糖、乳糖、蔗糖等各種生化鑒定管（由北京陸橋有限技術責任公司），藥敏紙片北京天壇藥物和其他試劑均按常規方法配制。

1．1．4 主要儀器 PCR擴增儀（東勝創新生物科技有限公司），TGL－16G臺式高速離心機（上海安亭科學儀器廠），DYY－6C電泳儀（北京市六一儀器廠），ZHWY－103B恒溫培養振蕩器（上海智城分析儀器制造有限公司），BIO－BEST200E凝膠成像分析系統（美國西盟國際公司）。

1．1．5 實驗動物 小鼠（購自北京維通利華實驗動物技術有限公司）。

1．2 方法

1．2．1 分離培養及生化鑒定 將腹瀉病死仔貉肝臟、脾臟、小腸內容物及其糞便分別劃線于SS和麥康凱平板中，經37℃24h培養后，每個平板挑取優勢菌落5～10個接種于克氏雙糖管中，在克氏雙糖管陽性，H2S陰性及動力陽性的，做系統生化實驗。1．2．2 血清型鑒定 挑取優勢菌落編號為H1、H2菌株接種于普通瓊脂斜面小管，置37℃培養24h，用0．5%的石碳酸生理鹽水2 m L洗下普通瓊脂斜面培養物，制成濃稠菌懸液，高壓下滅菌2 h，破壞其“k”抗原，制成高壓抗原。用各種標準單因子血清進行玻板凝集反應，同時以抗原與0．5%石碳酸生理鹽水混合物作對照，觀察有無自凝現象。30 s內出現明顯的凝集（＋＋）判為陽性。

1．2．3 分子生物學鑒定

1．2．3．1 基因組DNA的提取 挑取優勢菌落編號為H1、H2菌株接種于LB培養基搖菌后，用樹脂型TM基因組DNA提取試劑盒（北京賽百盛基因技術有限公司）進行基因組的提取，取3μL基因組DNA進行電泳（1%瓊脂糖、384V／30min）。－20℃保存備用。

1．2．3．2 引物設計

irp2：上 游 引 物：5′－AAGGATTCGCTGTTACCGGA－3′，下 游 引 物：5′－TCGGCCA GGATGATT CGTCG－3′，擴增基因片段大小301bp。

fyu A：上游引物：5′－ACACGGCTT TAT CCT CTGGC，下游引物：5′－GGCATATTGACG ATTAACGAA，擴增基因片段大小953bp。

1．2．3．3 PCR檢測及產物序列測定 按照Fermentas公司PCR試劑盒的使用說明書進行，反應程序：94℃預變性5 min；94℃變性30 s，58℃退火50 s，72℃延伸90 s，循環擴增30次；72℃延伸5 min。擴增結束后取5μL PCR產物進行1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，PCR產物送上海生工生物工程技術有限公司進行基因序列測定。

1．2．4 毒力試驗 將檢測出的攜帶小腸結腸炎耶爾森菌HPI毒力島基因的大腸桿菌H1、H2菌株分別接種無菌肉湯培養基，37℃培養18～24 h，然后取肉湯培養物，分別腹腔注射15～18 g健康小鼠，每只0．5 m L每株菌注射5只，觀察小鼠發病情況，對照組同法注射無菌肉湯，觀察7 d。

1．2．5 藥敏試驗 采用 WHO推薦的改良 KB法。

2 結 果

2．1 生化鑒定 生化結果基本一致，其結果為：葡萄糖＋、乳糖＋、蔗糖＋、山梨醇＋、甘露醇＋、靛基質＋、M．R＋、V－P＋、枸櫞酸鹽－、尿素－、動力＋、硫化氫－、氰化鉀－、苯丙氨酸－、賴氨酸＋、氨基酸對照－。2．2 血清型鑒定 挑取優勢菌落編號為H1、H2菌株，用大腸桿菌標準單因子血清進行玻板凝集，H1菌株的血清型為O23，H2菌株的血清型為O20。

2．3 分子生物學鑒定

2．3．1 基因組DNA的提取 按照樹脂型TM基因組DNA提取試劑盒說明書所述方法進行了大腸桿菌H1和H2菌株基因組DNA的提取，得到了基因組DNA的條帶，見圖1，表明成功提取大腸桿菌基因組DNA。

2．3．2 毒力基因的PCR擴增 應用特異性引物，以大腸桿菌基H1和H2菌株基因組DNA為模板擴增出了大小約301bp和953 bp的特異性條帶，見圖2，大小與預期結果基本一致，表明成功擴增并檢測到大腸桿菌H1和H2菌株的irp2和fyu A基因。

2．3．3 毒力基因PCR擴增產物序列測定 將擴增大腸桿菌H1和H2菌株irp2和fyu A基因產物送至上海生工生物技術有限公司進行測序，結果測定出H1和H2株大腸桿菌irp2和fyu A基因序列。

2．3．4 與參考菌株不同血清型大腸桿菌毒力島同源性比較 用DNAstar生物軟件對所測序列和NCBI GenBank中已發表的irp2基因序列比對，結果顯示：試驗菌株H1和H2菌株O23、O20的irp2基因序列與參考菌株O1、O7、O26、O42及O83的irp2基因序列的同源性在98．5%～99．2%之間，試驗菌株H1和H2菌株O23、O20的同源性為99．3%，見圖3。按同源性排組原則構成了大腸桿菌的系統進化樹：從irp2基因進化樹形圖上可以看出所列不同血清型大腸桿菌毒力島irp2基因分為2群，試驗菌株H1和H2株O23、O20為Ⅰ群，參考菌株O1、O7、O26、O42及O83為Ⅱ群，見圖4。

試驗菌株H1和H2株O23、O20的fyu A基因序列與GenBank中的參考菌株O1、O7、O26、O42及O83的同源性在98．9%～100%之間，2個試驗菌株H1和H2株O23、O20的同源性98．9%，見圖5；從進化樹形圖上可以看出所列不同血清型大腸桿菌毒力島fyu A基因分為3群，試驗菌株H1株O23與參考菌株O26、O1、O83及O7為Ⅰ群，參考菌株O42為Ⅱ，試驗菌株H2株O20為Ш群。試驗菌株H2株O20與參考菌株O42株親緣關系較近，與試驗菌株H1株O23株親緣關系較遠，見圖6。

圖5 fyuA基因序列同源性分析Fig．5 Sequences homologous analysis of fyuA gene from E．coli

圖6 fyuA基因核苷酸序列系統發育樹Fig．6 The phylogenetic tree of nucleotide sequence of fyuA genes

上述結果根據貉腹瀉大腸桿菌irp2、fyu A 2種基因片段同源性分析結果可以看出，貉腹瀉大腸桿菌H菌株HPI毒力島相關基因irp2和fyu A基因片段與GenBank中各參考菌株irp2和fyua基因片段核苷酸序列具有高度的同源保守性，說明HPI毒力島irp2和fyu A相關基因一般情況下較少發生變異。因此具有HPI毒力島irp2和fyu A相關基因的大腸桿菌的毒力也很難發生變異，該結果既說明了HPI毒力島irp2和fyu A相關基因在水貂腹瀉大腸桿菌中的存在，也說明了水貂腹瀉的發生和死亡與HPI毒力島irp2和fyu A相關基因有著密切的關系。

2．4 毒力試驗 攜帶小腸結腸炎耶爾森菌HPI毒力島基因irp2和fyu A大腸桿菌H1和H2的肉湯培養物分別腹腔感染小鼠后，均在24 h左右發病，表現為呼吸急促、食欲不振、雙眼半閉、聳毛、運動遲緩等癥狀，72 h之內相繼死亡。解剖死亡的小鼠，發現小腸水腫，腸腔積液等，取腹水、腸內容物培養，仍獲原感染菌。對照組觀察7 d仍健康如常。

2．5 藥敏試驗 檢測出的2株攜帶有小腸結腸炎耶爾森菌HPI毒力島基因irp2和fyu A的大腸桿菌對諾氟沙星、氧氟沙星、環丙沙星、卡那霉素、慶大霉素、妥布霉素、頭孢唑啉、氯霉素、痢特靈敏感，對氨芐青霉素和紅霉素耐藥。

3 討 論

從3個貉場腹瀉發病死亡仔貉的臟器及糞便中分離到細菌，經系統生化鑒定，確為大腸桿菌，血清鑒定為O23和O20。我們用PCR方法對其HPI毒力島進行了檢測，檢出了HPI毒力島基因irp2和fyua。且小鼠毒力試驗證實是具有毒力的菌株，與臨床癥狀有關。根據流行病學調查其腹瀉仔貉的臨床表現，其典型的臨床癥狀為食欲不振，精神沉郁，腹瀉灰白色糞便，多為粘液便，仔貉多為體溫正常或低熱，有的仔貉腹瀉后死亡，貉場仔貉發病率31%情50%，藥敏實驗結果表明該菌對諾氟沙星、氧氟沙星、慶大霉素等敏感，臨床采用諾氟沙星拌料、對腹瀉嚴重仔貉用慶大霉素灌服病仔貉療效較好。

毒力島是外源基因，它借助于可移動性的載體成分進入細菌并插入到染色體上一些特殊的位置（如t RNA位點），賦予宿主菌一些新的毒力特性，也可以通過重組發生缺失，并能在不同的細菌間進行水平傳播，它主要含有與細菌毒力有關的一些基因。小腸結腸炎耶爾森菌HPI毒力島為45Kb大小，主要的結構基因為irp2和fyu A，該毒力島賦予了此菌以特殊的毒力，也與該菌的致病性密切相關。毒力島基因irp2和fyu A是耶爾森菌的主要基因，我們在腹瀉仔貉臟器小腸及糞便中檢出攜帶有小腸結腸炎耶爾森菌H PI毒力島基因irp2和fyu A的大腸桿菌，該類菌對仔貉健康具有潛在性的威脅，應引起重視。

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Detection on pathogenicity islands of Yersinia enterocolitica HPI from Escherichia coli strains in diarrheic young raccoon dogs

ZHANG Yan－ying，SHI Qiu－mei，FANG Hai，CHEN Cui－zhen，LIU Ya－jun，YANG Yue－lin
（Key Laboratory of Hebei Province Preventive Veterinary Medicine，Hebei Normal University of Science ＆ Technology，Changli 066600，China）

To understand the mechanism of E．coli caused diarrhea in young raccoon dogs，HPI pathogenicity islands were detected to carry out Yersinia enterocolitica．Pathogenicity islands gene irp2 and fyu A were detected by PCR amplification，and the virulence of E．coli strains was determined with mice by intraperitoneal injection．E．coli strains were isolatted from organs and feces of diarrhic young raccoon dogs，of which the serotypes were O23 and O20．In pathogenicity islands gene irp2 and fyu A，2 serotypes of E．coli were detected and resulted in the occurrence of serious illness and the death of experimental mice after intraperitoneal injection in virulence detection．Diarrhea in young raccoon dogs infected with E．coli and carrying pathogenicity islands gene irp2 and fyu A of Yersinia enterocolitica HPI，will bring potential threats to the health of young raccoon dogs．

diarrhea；pathogenicity islands gene irp2 and fyu A；Yersinia enterocolitica；young raccoon dogs

R378

A

1002－2694（2012）02－0179－04

＊河北省科技支撐計劃（No．08220401D，No．10960408D）和中國博士后基金（No．20100470565）和青島市科技項目（No．2001A182）聯合資助

史秋梅，Email：shiqiumei＠yahoo．com．cn

河北科技師范學院動科院 河北省預防獸醫學重點實驗

室，昌黎 066600

2011－11－18；

2011－12－05