MicroRNA及其研究現狀＊

呼高偉，陳兆國，程天印，許 娟

MicroRNA及其研究現狀＊

呼高偉1，2，陳兆國2，程天印1，許 娟3

MicroRNA（miRNA）是一類非編碼的內源性小RNA分子，長度約20～25個核苷酸（nucleotides，nt），參與調控諸多基因的表達。miRNA的作用方式有2種：一種是通過與靶標基因mRNA的完全匹配結合，促使m RNA發生降解；另一種是通過不完全地與靶mRNA的3′非編碼區（3′untranslatied region，3′UTR）互補結合，抑制靶m RNA的翻譯，將蛋白控制在生命活動所需要的最佳水平上。這些靶m RNA會進一步調控機體的多種生物學行為，如機體發育進程、細胞分化、細胞凋亡、腫瘤以及疾病的發生等。因此，全面而深入地了解miRNA的發生、作用機理和功能，將會揭示這些生物過程發生的機理以及一些疑難疾病的分子基礎。本文通過對miRNA的發現、結構特征、合成與作用機制、分析方法、功能及應用進行綜述，對下一步研究進行展望，以期為利用miRNA研究成果進行新藥研制、疾病診療提供新的思路和理論基礎。

1 miRNA的發現

1993 年，Lee等［1］在對秀麗隱桿線蟲 （Caenorhabditis elegans）進行突變體遺傳分析時，發現一種控制細胞發育時序的長度約為22 nt的RNA lin－4，通過堿基配對的方式結合到靶mRNA lin－14的3′UTR，從而抑制lin－14的翻譯，但不影響其轉錄。2000年，Reinhart等人［2］在線蟲中發現了另一種重要的具有轉錄后調節作用的miRNA－let－7。從而使lin－4和let－7成為了miRNA家族的奠基性成員。在隨后的一段時間里，許多研究者相繼在其他物種中也發現了miRNA，這類小分子不僅在發育階段起作用，同時也在不同的組織器官中表達，起到調節個體生理代謝的作用。miRNA的發現為研究生物的基因表達調控機制提供了新的視角。

2 新miRNA的判斷標準

新的miRNA識別和鑒定的最初方法主要是采用構建c DNA文庫進行測序，但是該方法的最大缺陷是新的miRNA會受到其它一些小分子RNA的影響，導致假陽性的產生。因而為了將miRNA與siRNA、其 他 非 編 碼 小 分 子 RNA （non－coding RNA，ncRNA）或 mRNA 片段區分開，Ambros等［3］從RNA的生成、表達的角度提出了miRNA生成的判斷標準為：（1）具有發夾結構前體，且miRNA序列在前體的一條臂上，發夾結構具有最低自由能，結構中不應含有大的內環或泡，尤其是大的不對稱的泡；（2）miRNA序列及其前體在二級結構上具有進化上的保守性；（3）隨著Dicer酶功能的降低，前體能夠不斷積累。

3 miRNA的結構特征和特點

miRNA的一個明顯特征是轉錄它的前體常能形成分子內莖環結構，而且含有大量的U／G堿基對，這個前體需要經過核酸酶的進一步加工后形成成熟的miRNA。miRNA有以下5個明顯的特點：（1）廣泛存在于真核生物中，是一組不編碼蛋白質的短序列RNA，且不具有開放閱讀框（open reading frame，ORF）；（2）一般長度為20 nt～24 nt，但在3′端可以有1～2個堿基的長度變化；（3）成熟的miRNA 5′端有一磷酸基團，3′端為羥基，這一點使它與大多數寡核苷酸和功能RNA的降解片段區別開來；（4）幾乎所有的miRNA都是來自于前體的一條臂，無論是5′端還是3′端；（5）動物 miRNA的前體長度大約在60 nt～80 nt，而植物miRNA的前體長度變化幅度較大，一般從幾十到幾百nt［4］。除此之外，多數miRNA還具有高度保守性、組織特異性和時序性。

4 miRNA的合成和作用機制

在細胞核內編碼miRNA的基因轉錄成初級轉錄本（primary miRNA，pri－miRNA）。pri－miRNA在一種叫Drosha的RNase的作用下，剪切為長度約70 nt、具有莖環結構的miRNA前體（precursor miRNA，pre－miRNA）［5］。pre－miRNA 在 Ran－GTP依賴的核質／細胞質轉運蛋白Exportin 5的作用下，從核內運輸到胞質中。在雙鏈RNA專一性RNA內切酶Dicer的作用下，miRNA的前體被剪切成21 nt～25 nt長度的雙鏈miRNA。成熟的miRNA與其互補序列互相結合成所謂miRNA：miRNA＊雙螺旋結構（miRNA＊是miRNA的互補序列）；隨后，雙螺旋解旋，其中一條結合到RNA誘導的基因沉默復合物（RNA－induced silencing complex，RISC）中，形成非對稱RISC復合物（asymmetric RISC assembly）［6］。在動物中，該復合物會結合到目標靶mRNA上，在大多數情況下，復合物中的單鏈miRNA與靶mRNA的3′UTR不完全互補配對，從而阻斷后者的翻譯過程。

5 miRNA的分析方法

迄今發現新的miRNA的方法主要有3種［7］。第1種方法是首先構建長度為16 nt～28 nt的小分子RNAs的cDNA文庫，再將這些cDNA進行克隆、測序，然后將克隆序列用Blast軟件等在該物種基因組數據庫中進行同源性搜索，將具有同源性的基因組序列用Mfold軟件進行二級結構預測分析，最后將具有發夾結構的小分子RNA進行Northern雜交或熒光定量PCR分析，檢測其表達情況，最終將符合miRNA標準的小分子RNA鑒定為新的miRNA。

第2種方法是利用生物信息學軟件進行預測。隨著生物信息學技術的發展，一些預測生物體中可能存在microRNA基因的軟件被開發出來，用這些軟件對物種的全基因組序列進行分析，可以挖掘新的miRNA。對于沒有進行全基因組序列測定的物種，可在已知miRNA基因附近搜索基因簇。

第3種是高通量測序與生物信息學相結合的方法。首先對該物種小RNAs進行高通量測序，在進行生物信息學處理前要先行去除3′接頭、3′端和5′端空載體等污染片段，然后通過與該物種基因組進行比對定位，進一步排除其他污染片段并統計其分布信息。在此基礎上，通過數據庫比對等方法，對測序片段進行分類，去除核糖體 RNA（ribosome RNA，r RNA）、轉運RNA（transfer RNA，tRNA）、小核RNA（small nuclear RNA，sn RNA）、核仁小分子RNA（small nucleolar RNA，snoRNA）、其他ncRNA以及重復序列等。用去除了這些非編碼小RNA及重復序列且在基因組上有良好定位信息的片段搜索miRNA數據庫，獲得已知miRNA信息；未獲得比對結果的片段可作為miRNA候選片段。

6 miRNA的生理功能

6．1 參與細胞增殖和分化 2002年，Hipfner等在果蠅中發現了第1個與增殖相關的miRNA基因—Bantam，該基因參與編碼了果蠅幼蟲抑制程序性死亡和促進細胞增殖的miRNA。通過生物信息學方法，作者發現Bantam的靶基因為Hid，而Hid是程序性死亡的主要激活因子。Bantam與Hid的m RNA的3′UTR互補結合，阻止了Hid的mRNA翻譯，進而抑制蛋白的表達，最終起到了促進細胞增殖的作用。相反，如果敲除Bantam，Hid的表達水平將上調，誘導凋亡的發生，從而抑制細胞增殖［8］。

動物中的miRNA還參與細胞分化。miR－23與Hes－1基因能夠較好地互補（互補性約為77%）。Hes－1以一種基本的螺旋－環－螺旋結構存在，它只在未分化細胞中表達。研究者將人工合成的miR－23加入到未分化的NT2神經細胞中，發現細胞內Hes－1基因的表達水平明顯下降。但是將人工合成的miR－23突變體加入到未分化的NT2細胞中，Hes－1基因的表達水平保持不變，且其含量與將野生型miR－23加入到已分化的NT2細胞中是一樣的，這表明miR－23在翻譯水平上抑制了 Hes－1基因的表達，從而影響細胞分化［9］。

6．2 調控基因的表達 如前所述，miRNA對基因表達的調控主要是通過轉錄后的調控來實現的，miRNA通過與m RNA的3′UTR作用，從而抑制翻譯的進行，最終抑制特定基因的表達。那些可以被miRNA調控的基因大多參與細胞的發育過程。6．3 調節細胞周期 miRNA對細胞周期有反饋調控作用，并且這種反饋調節機制在細胞中廣泛存在。比如，人體內轉錄因子E2F家族是參與細胞周期調控和凋亡過程的重要分子，家族中E2F1、E2F2和E2F3（合稱E2F1－3）可使靜止的細胞進入S期。內源性的E2F1－3直接與人的13號染色體上含有6個miRNA的miR－17－92簇啟動子結合，活化miR－17－92簇的轉錄，所生成的 miR－17－92家族 成員miR－20a反過來抑制E2F1－3的翻譯過程，這樣便在E2F1－3和 miR－17－92簇之間形成了調節的反饋抑制環路。從而影響E2F的蛋白合成，進而監控細胞周期中E2F分子的異常積累，對增殖信號進行控制，嚴格調控細胞周期［10］。Melton等［11］報道，miR－NA let－7參與抑制胚胎干細胞中的自我更新程序。這種抑制可以被一組胚胎干細胞ESCC miRNA（調控型miRNA，它們調控細胞周期）逆轉，說明let－7和ESCC miRNA之間的互動作用提供了一個能夠支配細胞命運的機制。

6．4 影響激素的分泌 Poy等［12］從葡萄糖誘導的鼠胰島 β細胞系（murine pancreaticβ－cell line）MIN6及鼠胰島α細胞系（murine pancreaticα－cell line）TC1的總RNA中克隆出了大量長度為21～23 nt的RNA，從中鑒定出了67種不同的miRNAs序列，其中11種是首次發現。在這些新的克隆產物中，miR－375含量最多。Northern雜交結果表明，miR－375只在MIN6、TC1及鼠胰島中出現，在外分泌型胰腺細胞、肺、肝臟、脂肪、小腸、腎、脾、腦、心以及其他檢測的組織中均未發現。而miR－376也只在MIN6和鼠胰島細胞中特異表達。這些結果表明部分胰島特異的miRNAs已經被鑒定出來。

6．5 miRNA與骨關節炎發生的關系 骨關節炎是一種嚴重的關節性疾病，miRNA－140與骨關節炎有著密切的關系。Miyaki［13］等通過細胞實驗發現，骨關節炎患者的軟骨細胞miRNA－140的表達水平明顯低于正常人軟骨細胞miRNA－140的表達水平，并且白細胞介素Ⅰ能抑制miRNA－140的表達水平。這說明在炎癥狀態下，miRNA－140的表達水平受到了影響，從而引發骨關節病的發生。

6．6 miRNA與腫瘤發生的關系 在腫瘤中miRNA的表達通常不受限制，而miRNA有數百個靶標，因此探明特異性miRNA和其靶標的相互作用與腫瘤發生的相關性是當前面臨的主要問題。Bartel［14］報道，阻斷miRNA對哺乳動物的一個單基因的調節會導致腫瘤基因的激活，研究人員檢測了編碼高移動組A2（high mobility group protein，HMGA2）蛋白的基因。HMGA2蛋白通過改變染色質結構來調節基因在多種癌癥發生的早期表達，它是腫瘤中染色體重排的靶標，這樣會使其羧基端和m RNA的3′UTR的缺失。但小鼠的HMGA2的3′UTR包含7個保守的let－7 miRNA補償位點，它們在腫瘤發生的晚期表達，揭示了let－7可能調控HMGA2的表達。將let－7導入F9小鼠胚胎腫瘤細胞中，能抑制HMGA2的表達；而抑制內源性let－7則增加NIH3T3細胞中HMGA2的表達。以F9細胞為模型，構建HMGA2的3′UTR突變體，阻斷了其中2個或7個let－7的補償位點，結果發現，let－7共轉染誘導HMGA2下調的水平與完整位點的數目有關，且這種抑制可以被共轉染的、突變HMGA2的3′UTR的突變體或者是突變let－7的結合突變體逆轉。由此提示，let－7能夠直接抑制HMGA2。含野生型HMGA2開放閱讀框而無突變的let－7結合位點的載體穩定表達則導致NIH3T3細胞的非貼壁依賴性生長，這些細胞也可在免疫缺陷鼠體內形成腫瘤，提示let－7是通過直接抑制癌基因來實現腫瘤抑制功能［15］。這些研究表明，miRNA介導的基因調節的缺失可能是腫瘤發生的共同機制，在研究癌癥相關突變時應予以考慮。

6．7 miRNA的免疫調控作用 最近，研究者發現miRNA參與了免疫細胞的發育和炎癥的發生等多種生理病理過程。比如，miR－155參與調控T、B細胞的分化，與B細胞抗體類別的轉換密切相關；miR－17～92參與了B細胞的生長發育；miR－150負向調控B細胞發育和炎癥反應；miR－181a參與T細胞的生長發育；miR－146a則參與負向調控炎癥反應。而且，miRNA調控的免疫反應在應對刺激因子和病原過程中存在復雜的調控網絡［16］。Ruggiero等［17］對miRNA調控炎癥反應的發生機制進行了研究。作者分析了miRNA在受脂多糖（LPS）誘發的巨噬細胞活化中所起的作用，結果發現LPS顯著誘導了miR－155的表達，而該誘導是通過KSRP（KH type shearing regulated protein，KH 型剪切調控蛋白）促進miR－155的成熟實現的。作者還證明，同時抑制miR－155和KSRP，能夠提高LPS誘導的特定炎癥介質的表達水平。

7 miRNA的應用

隨著科學技術的發展和對miRNA研究的深入，miRNA的應用研究逐漸展開，在許多新的領域不斷取得進展。

7．1 新型基因治療方案的設計和發展 miRNA介導的基因活性調控機制的闡明可能對分子水平鑒定和治療疾病有著重要的作用。理論上，原癌基因和轉基因的表達都能被合成的miRNA抑制，這是一種簡單有效的基因治療手段。因此，目前已知一些人類疾病包括癌癥和心血管系統失調等均涉及miRNA或其機制，利用miRNA特異地敲除靶基因可作為一種簡單的基因治療手段。

7．1．1 在抗病毒治療方面的應用 2009年12月，科學家們報道了應用miRNA治療丙型肝炎的新方法，丙型肝炎病毒通過miR－122（它在肝臟中有表達）來感染肝臟中的細胞。Lanford等［18］在對黑猩猩的研究中，應用一種被稱為SPC3649的化合物來阻斷在4個感染了丙型肝炎病毒的黑猩猩中的miR－122。結果發現，這種治療手段可有效減輕黑猩猩丙型肝炎的癥狀，而且該丙肝病毒沒有產生抵抗力。如果進一步的臨床試驗成功，這可能成為丙型肝炎治療的有效途徑。此外，miRNA與很多疾病的致病機制有關，如病毒如何建立潛伏感染及逃避宿主天然或適應性免疫系統。因此，揭示miRNA在與人類疾病相關的細胞活動中的作用將開辟蛋白功能調控的新機遇，而且有助于對其在干預治療中的潛力進行評價。

7．1．2 在腫瘤治療中的作用 由前文所提miRNA的生理功能可知，miRNA相關的腫瘤發生通常是由于某些特定的miRNA低表達或者不表達，或者某些特定miRNA的高表達。編碼let－7家族的分子可以用于治療某些特殊腫瘤如肺癌等，通過病毒或脂質體將miRNA分子轉染細胞，這些技術通過在組織特異性的啟動子控制下，表達pre－miRNA發夾和側序列，激起內源性的miRNA加工和產生，以抑制靶基因。2010年，Ding等［19］在肝癌染色體變異區內鑒定了肝癌轉移促進因子miR－151，發現染色體8q24．3位點的擴增導致了miR－151及其宿主基因FAK在肝癌中的高表達。而miR－151的過表達將會顯著增加肝癌細胞的遷移與侵襲能力，并促進肝癌細胞發生肝內轉移。研究者進一步鑒定出RhoGDIA基因是miR－151的靶基因，介導miR－151的促肝癌轉移功能。miR－151與宿主基因FAK協同作用活化Rac、cdc42及Rho GTPase，進而促進肝癌細胞的遷移、侵襲與轉移。通過利用抗miRNA的方法來抑制miRNA的表達，使腫瘤細胞的轉移得到抑制。上述研究為肝癌治療提供了新的思路，同時也為將抑癌miRNA的全身給藥作為一種抗癌途徑提供了理論依據。

7．2 在腫瘤檢測中的應用 尋找腫瘤標志物并對其進行準確檢測一直都是癌癥研究領域的重點。Wang等［20］研 究 了 miR－21、miR－210、miR－155 和miR－196a等4個miRNA在胰腺癌患者和健康人群血清中的表達情況，結果發現結合4個miRNA的表達水平對胰腺癌的診斷其敏感性為64%、特異性為89%，因此認為血清microRNA作為腫瘤診斷和預后的標志物，可應用于早期腫瘤的檢測，而且檢測損傷小、靈敏度高、穩定性好，值得進一步研究。

7．3 在抗心律失常方面的應用 近年來，研究者發現了miRNA在心血管系統中的關鍵調控作用，miRNA通過調節多種心血管系統中重要蛋白的表達，參與心臟發育和心臟的病變過程，如心肌肥厚、心肌衰竭、心律失常等。miRNA參與調控多種心臟電活動相關蛋白的表達，例如HCN2（竇房結通道蛋白2）、HCN4、GJA1、KCNJ2、KCNH2、KCNQ1、和ERK等，miRNAs的失衡將引起這些離子通道蛋白的功能失調進而導致心肌肥厚、心力衰竭和心肌缺血時惡性心律失常發生，因此，miRNA是潛在的心律失常作用靶點。另外，動物實驗證明，miR－1和miR－133在心肌組織表達量最為豐富，與各種心律失常關系密切。Ai等［21］研究發現急性心肌梗死病人外周血miR－1在治療前后表達量明顯不同，治療前miR－1含量顯著增高，治療后恢復至正常水平。此研究提示，miR－1可能成為潛在預警心肌缺血性心律失常發生的生物標志物，并有望研制出能快速檢測miRNA的試劑盒，用于臨床預警心肌缺血性心律失常或評估心臟猝死發生的危險性。以miRNA作為治療靶點，不同于經典的治療方法，是通過調節靶基因m RNA的穩定性或抑制翻譯過程而發揮作用的。

7．4 在功能缺失轉基因動物建立過程中的應用

利用miRNA及其沉默靶基因表達的機制已經發展出一種新的、簡單的方法，用于建立功能缺失轉基因動物。例如，為了確定miRNA作用過程中的關鍵分子，通過人工構建的miRNA，現已建立起功能缺失突變的斑馬魚模型。由于啟動子的不相容性，功能缺失的轉基因斑馬魚不能利用siRNA，而是用內含子miRNA來完成。miRNA轉基因動物模型的潛在應用是在體內檢測基因的功能和藥物的作用機制，由于這種策略可產生用于功能缺失研究的miRNA，所以該類型的動物模型又為miRNA研究提供了空前的資源。

7．5 在育種中的應用 李秋玲等［22］利用實驗方法進行了中國荷斯坦牛HSF1基因microRNA SNPs與耐熱性能的相關性研究。結果發現了2個miRNA種子序列新SNPs——T909C和G4693T。該研究首次發現中國荷斯坦牛HSF1基因miRNA SNPs與熱應激反應存在顯著相關，從而說明HSF1基因miRNA SNPs可作為選育高耐熱性奶牛的新遺傳標記應用于育種實踐中。

8 存在的問題及研究展望

雖然miRNA的研究己經取得了很大的進展，但從現有的研究成果來看，還存在一些問題亟待解決，如：（1）除現有的幾種模式生物的miRNA外，更多物種的miRNA還有待于進一步發現；（2）miRNA基因的轉錄和miRNA加工的信號通路尚未完全確定；（3）目前研究的miRNA的作用形式單一，是否存在其他的作用形式尚無法確定；（4）如何解決3′端不完全與目的靶基因匹配而引起的靶標位點鑒定上的困難尚無很好的解決辦法；（5）miRNA靶基因的預測存在假陽性的問題，以及其與靶基因的相互作用機制問題尚待解決；（6）目前的研究僅限于miRNA在正常或疾病狀態下的表達譜變化問題，而miRNA在正常組織發育和疾病發生中所發揮的具體作用機制的相關報道尚很少；（7）miRNA的實際應用還有待于進一步拓展。

盡管目前miRNA的研究還基本處在理論層面上，但是研究者已經可以系統地鑒定miRNA及其靶基因，并通過過量表達或沉默技術來研究特殊miRNA的功能［23］。人工構建的miRNA也能特異性地降解靶m RNA，為在分子水平上研究新一代藥物提供了除siRNA以外的另一個切入點。所以，研究者利用過量表達或沉默技術研究特殊miRNA的功能、開展拮抗miRNA的化學合成藥物研究等，對以miRNA為基礎的疾病診斷和治療策略具有重要意義。相信隨著研究的深入，miRNA研究中存在的上述問題將會被逐步解決，其必將在生命起源和物種進化、基因表達調控的復雜性、疾病發生和發展的機制等方面發揮更為深遠的作用，有助于科學家們對眾多生命之謎的進一步破解。

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Q522

A

1002－2694（2012）02－0167－05

＊國家科技重大專項項目（2012ZX10004220－008）；中央級公益性科研院所基本科研業務費專項資金項目（2010JB12，2012JB16）；上海市科技興農重點攻關項目［No．滬農科攻字（2005）3－4］聯合資助

陳兆國，Email：zhaoguochen＠shvri．ac．cn；

程天印，Email：cty68＠yahoo．cn

1．湖南農業大學動物醫學院，長沙 410128；

2．中國農業科學院上海獸醫研究所農業部動物寄生蟲學重點開放實驗室中國農業科學院動物源性食品安全研究中心，上海 200241；3．河南安陽市湯陰縣畜牧獸醫總站，湯陰 456150

2011－10－20；

2011－11－28