幽門螺桿菌蛋白晶體結構的研究與應用

宮雅楠，張建中

幽門螺桿菌蛋白晶體結構的研究與應用

宮雅楠，張建中

幽門螺桿菌（Helicobacter pylori，簡稱H．pylori或Hp）是微需氧的革蘭氏陰性菌，并引起嚴重的胃十二指腸疾病，例如消化性潰瘍、胃炎及胃癌等，WHO將其確定為I類致癌因子［1］，世界人口中約半數處于慢性感染狀態。由于其嚴重的致病性，近來關于機制的研究及藥物開發受到更多的關注，蛋白晶體結構的研究與應用更是成為一個關注的焦點。

1 幽門螺桿菌蛋白結構分析中的研究方法

電子顯微鏡（EM）主要用于細菌形態的研究，目前常用于分析Hp的表面結構。新近發展起來的低溫電鏡技術（cryo－genic EM）是低溫冷凍技術與電子顯微鏡相結合，可以獲得更精細的細菌結構，甚至可獲得生理狀態下細菌的內部結構［1］，但這些方法都無法獲得原子水平的蛋白結構。

20世紀末，隨著分子生物學技術的發展，細菌蛋白的表達及純化變得相對容易，從而使進一步從原子水平上研究細菌蛋白結構及功能成為可能，主要包括核磁共振技術及X射線衍射技術。

核磁共振技術（NMR）可用于測定蛋白的液相結構，NMR測定曾被用于Hp0222蛋白在溶液中的液相機構，并發現其以二聚體形式存在，結構由帶－螺旋－螺旋方式組成，具有轉錄調節因子的ARC／METJ家族特性，都能與DNA結合形成高級有序寡聚體［2］。而對Hp0892的溶液結構分析發現其含有3個α－螺旋，5個β－股形成一個5股β－折疊片，它屬于質粒穩定系統蛋白家族。NMR僅限于分子量不大于30 kd～40 kd小分子蛋白的分析，且所得到的信息不能被現有的其它分析技術解譯［3］。

X－射線衍射技術目前應用廣泛，通過這種方法已經測定出大量蛋白的三維結構。它是基于蛋白結晶的重要結構分析方法，能夠對蛋白形成的晶體進行X－射線衍射分析，從而可在原子水平上認識蛋白結構。蛋白晶體生長環境中一般含有30%～90%的溶劑，有助于維持蛋白的天然構象，使蛋白結構及功能的推測與研究更具有可靠性［1］。

Hp蛋白的三維結構解析是認識其蛋白功能及致病機制的有力手段，對其結構的認識經歷著電鏡結構到其組成蛋白原子水平3D結構的變化。目前通過X－射線衍射技術已獲得上百種幽門螺桿菌蛋白的晶體結構，對其蛋白功能、致病機制、免疫機理及藥物設計提供了重要技術支持。

2 Hp蛋白晶體結構分析用于蛋白功能研究

已有大量Hp蛋白通過與其他生物或微生物已知功能蛋白的序列比對推測出其功能并通過生化實驗得以驗證，其獨特的三維結構決定了它們功能的多樣性及復雜性，因此結構的測定能夠更好地了解這些蛋白的功能特性。

Hp細菌定植及持續感染機制相關研究發現，大量蛋白參與其中，但這些蛋白大多在功能上是未知的，晶體結構成為揭示其功能的有力手段。Hp1286與Hp1287（ten A）都與定植相關，晶體結構分析發現Hp1286為對稱二聚體，屬于YceI－類似蛋白家族，可能具有一些長鏈脂肪酸或酰胺的貯存及轉運功能，能夠吸收環境中的脂肪酸或酰胺，為細菌代謝提供必需的脂肪酸，或保護細菌免于受到脂肪酸抗菌活性的毒性作用［4］；發現Hp1287能形成222對稱同源四聚體，屬于硫胺素酶II家族，參與硫胺前體羥嘧啶合成的補救途徑中，構成了硫胺生物合成的一個模塊，但其對底物4－氨基－5－氨甲基－2－甲基嘧啶的活性稍差［5］。

Hp蛋白晶體結構的測定也被用于揭示蛋白的活性作用位點及關鍵氨基酸殘基部位。尿素酶成熟蛋白（UreE）與Cu2＋及Ni2＋結合的晶體結構分析表明，UreE與離子結合后形成四聚體，通過His102排列圍繞在金屬離子周圍。與His102的結合能夠增加局部金屬離子的濃度，從而可傳遞更多的鎳離子［6］。甲酰胺酶AmiF的晶體結構揭示出甲酰胺結合袋由Cys166、Glu60和Lys133殘基組成，其中Cys166是親和基團，C166S突變體可導致蛋白失活［7］。

在Hp的全部蛋白中大約1／3的蛋白沒有尋找到序列上的同源物，它們的功能及三維結構從未被描述過。對這些蛋白的理解對潛在抗菌藥物的發現提供基礎，其功能及結構測定受到更多的關注。例如Hp0336基因編碼一種富含半胱氨酸的蛋白Hcp B，其結構包括四個α／α－基序，通過二硫鍵交連起來。重復子與三四氨基酸重復基序（tetratricopeptide repeat，TPR）相似，許多TPR蛋白參與到細胞周期調節，蛋白轉運，以及分子伴侶協助蛋白折疊中，因此基于整體結構推測Hcp B也可能具有這些功能［8］，但對這些功能的深入認識，還有待于對其晶體結構的分析。

3 蛋白晶體結構分析用于Hp進化研究

通過比對Hp蛋白與其它物種蛋白間序列上的相似性程度，不僅能夠推測出蛋白可能的生物學功能，也能用于進化及分型研究。Hp有許多蛋白并未發現存在序列上的同源物，因此對其空間結構的分析和比對具有更重要的意義。

Hob A（Hp1230）能夠特異地與Dna A蛋白相互作用，通過晶體結構測定揭示了它具有糖異構酶（sugar isomerase，SIS）蛋白結構域，SIS蛋白與大腸桿菌的Dia A蛋白序列高度同源，但Hob A與大腸桿菌Dia A沒有序列同源性，結構比對發現它們二聚體／二聚體界面也是不同的，但具有相似的折疊方式，均為DNA復制調節因子，但Hob A已進化成Hp的存活必需因子［9］；YbgC（Hp0496）與大腸桿菌YbgC在序列上有30%的相似性，但具有相似的硫酯酶特性的熱狗折疊結構，揭示了ε－γ四聚體組裝形式在YbgC蛋白中是保守的，這種獨特的四聚化形式產生一個重要表面，由12股β－折疊片組成產生，這些區域能夠參與到特定相互作用，包括與Cag A的相互作用。基于其活性以及與大腸桿菌YbgC結構的比對，提出YbgC的催化核心是保守的，可能參與到脂酰輔酶A衍生物的水解［10］。

4 致病因子晶體結構與Hp致病機制研究

Hp致病性相關的因子包括空泡細胞毒素（Vac A）、細胞毒性相關蛋白 A （Cag A）、表面脂多糖LPS、尿素酶、鞭毛蛋白、粘附素等。

4．1 運動及趨化性因子 運動能力是通過極生鞭毛來完成的，對定植是必需的。鞭毛也參與到粘附及誘導宿主細胞炎癥應答中。由于運動性是毒力相關特性，改善了對鞭毛生物合成的理解，有利于發展干擾或治療策略［11］。

Hp鞭毛由2種鞭毛蛋白組成：FlaA和FlaB［12］。fla A1（Hp0840）基因產物能夠參與到鞭毛及LPS的合成，在Hp致病性及定植中起關鍵作用。fla A1基因的破壞可導致細菌鞭毛缺失即LPS缺失大部分O抗原結構。FlaA1序列表明它屬于短鏈脫氫酶／還原酶超家族，通過測定Fla A1·NADPH．UDP－Gal、Fla A1·NADP＋·UDP－Glc NAc、Fla A1·NADP＋·UDP－Glc、Fla A1·NADPH·UDP－Glc NAc及FlaA1·NADP＋·UDP－Gal 5種不同三元絡合物的晶體結構，表明此酶以六聚體形式存在，是一種新的短鏈脫氫酶／還原酶超家族成員，其催化唾液酸類似物pseudaminic acid（Pse）衍生物合成途徑的第一步，Pse與鞭毛糖基化相關，對功能性鞭毛的組裝是必需的［13］；Hp0366基因編碼的氨基轉移酶（PseC）在Pse生物合成途徑中起核心作用，同源二聚體構成活性位點，并鑒定出參與到中間體穩定與催化的關鍵殘基。進一步基于結構的定點突變證實了在催化過程中lys183的關鍵作用，能夠幫助解釋Pse生物合成途徑中氨基轉移酶反應機制［14］。

趨化性是Hp定植與感染的另一重要毒力因素。Hp的趨化系統的標志是多個感應調節因子的存在，包 含 CheY（Hp1067）、Che A（Hp0392）、CheW（Hp0391）以及較遠的 Hp0170基因編碼CheZ同源物。通過與大腸桿菌Bef－結合CheY活性位點殘基間的結構比對表明thrf 84在磷酸轉移反應中起重要作用，這是首次對Hp趨化系統的特性提供結構上的觀點［15］。已測定出的Bef3－活化的趨化蛋白Hp CheY1晶體結構，揭示了Bef3與Che Y1的結合機制，以及Bef3－Che Y1與Hp Fli M的相互作用的結構基礎。

4．2 Vac A及腫瘤誘發因子 Vac A是Hp分泌的一種細胞毒素，能夠引起哺乳動物細胞質內廣泛的空泡形成及多種細胞內效應。Vac A包含P33和P55兩個結構域，二者的結構域組分對Vac A寡聚化是必需的，其中P55結構域在調節Vac A結合宿主細胞中起重要作用，其顯著特性是存在一個由卷曲β－折疊片組成的右手平行螺旋狀結構，這是自主運載體結構域的典型特征，在已知的細菌蛋白毒素中具有獨特性。P55的結構特性還包括β－折疊片接觸的斷裂，導致5個β螺旋狀亞結構域形成，同時還含有1個二硫鍵的C－端結構域［16］。

在此基礎上，所構建的8個P55結構域缺失突變體分析結果表明在Vac A P55結構域的β螺旋狀片段中有一些靈活區域能夠耐受變化而對蛋白分泌或活性無毒性效應，同時發生相似改變的C－端結構域導致蛋白錯誤折疊和分泌損傷，證明非必需β螺旋狀卷曲以及C－端β螺旋狀片段對蛋白正確折疊是必需的，而大部分P55結構域對于Vac A毒素活性都不是必需的［17］。

腫瘤壞死因子－α（TNF－α）是腫瘤誘發的關鍵細胞因子之一，能夠誘導TNF－α的Hp蛋白，TNF誘導蛋白（Tipα），在胃癌發生中起重要作用。Tipα從Hp中以二聚體形式分泌，亞單位間通過二硫鍵連接，能夠進入胃黏膜上皮細胞，其單體包含兩個結構域組成（復合結構域及螺旋結構域），由4個α－螺旋，3個β－片層以及多個環組成。每個單體都有一定程度的伸長及彎曲，結構揭示其DNA結合新的折疊方式，2個單體間螺旋1，2間環所形成的陽離子表面對DNA結合非常重要［18］。

此外，通過構建出缺少N端6個氨基酸殘基LQACTC的Tipα突變體，對缺失2個半胱氨酸C5和C7缺失突變體的晶體結構分析發現，缺失后的Tipα具有一種新的延伸結構，含有一個40?長的α－螺旋，通過非共價鍵形成一個心型同源二聚體，這種折疊方式與Tipa同源二聚體非常相似，其獨特的二聚體形式對蛋白與蛋白間的相互作用以及Hp感染的致癌性機制提出新的觀點［19］。

4．3 金屬代謝相關因子 鐵是Hp生存的必需因子，參與到鐵代謝的蛋白均為重要的毒力因子。Hp鐵蛋白Hpf可控制菌體內可溶鐵的含量，保護細菌不受到酸放大鐵毒性的損害。與其它鐵蛋白家族成員相似，Hp鐵蛋白也是以2，4亞單體球蛋白外鞘形式組裝，其中每個單位都折疊成4α－螺旋簇，在低含量鐵結合狀態下構象無變化，但在中含量及高含量鐵結合狀態下，BC環及4折疊對稱通道入口處的his149咪唑環發生明顯的構象變化，表明鐵離子能與折疊通道中心結合，這與哺乳動物鐵蛋白不同。這些不同狀態下Hpf晶體結構的測定可以更好地理解鐵吸收及釋放的機制［20］，從而進一步加深對Hp致病機制和慢性感染機制的認識。

4．4 氧化應激因子 過氧化物歧化酶（SOD）是氧化應激的關鍵酶，Hp能產生一種SOD（Hp SOD），在2．4?分辨率下測定的SOD晶體結構是由兩個相同亞單位組成的二聚體，每個單體含有一個鐵離子。它與大腸桿菌中的對應酶間具有53%的序列相同性。與其它二聚化含鐵的SOD相比，包括金屬核心在內的主要Fe－SOD活性位點都是保守的，二聚體界面的特定相互作用模式也非常保守。結構差別主要集中在與亞單位界面較遠的區域，其中最關鍵的是一個由延伸的，由α－螺旋組成的20個氨基酸殘基構成的C端尾巴的存在，這個結構可能成為一種新的結構模型，推測這個延伸的C端可能與Hp SOD吸附細胞表面有關，Hp SOD可能在這個發生區域磷酸化［21］。

5 Hp蛋白晶體結構與抗菌藥物設計

在研究Hp蛋白質結構與功能過程中發現較多個潛在的抗菌藥物靶位，其中多數為代謝酶類。例如，腈脒合酶（PAPT）在腈脒生物合成過程中起作用，它由N端β股結構域及C端Rossmann類似結構域組成。兩個結構域間有一個獨特的結合袋、大量非保守殘基以及一個大的埋入空間。它對細菌生存是必需的，因此基于其典型的PAPT序列及不同的構象可作為潛在的抗菌藥物靶位［22］；此外還有丙二酸單酰輔酶A：?；d體蛋白轉酰酶（Malonyl－Co A：acyl carrier protein transacylase，MCAT），與其它物種的晶體結構具有高度相似性，是高度保守酶，也可作為抗菌藥物的靶位［23］。

細菌L－天冬酰胺酶已經用于治療兒童急性淋巴細胞白血病30多年了，其治療效應基于它們能夠催化腫瘤必需氨基酸L－天冬酰胺轉變成L－天冬氨酸和氨。2種L－天冬酰胺酶，大腸桿菌及歐文菌屬，已經作為抗白血病藥物廣泛應用于臨床實驗。但由于它們潛在的谷氨酰胺酶活性，L－天冬酰胺酶也能夠引起嚴重副反應。Hp的L－天冬酰胺酶HPA具有可忽略的谷氨酰胺酶活性，結構比對表明HPA與大腸桿菌的L－天冬酰胺酶結構更加相似［24］，提示可能具有更好的藥物研發前景。

6 展 望

蛋白分子的功能特性主要取決于它獨特的三維空間結構，X射線衍射是確定晶體三維結構最可靠的方法，但獲得蛋白質晶體仍是這一領域的主要技術瓶頸之一。Hp編碼蛋白中仍有大量蛋白，尤其是外膜蛋白，沒有獲得其結構分析結果。Hp外膜蛋白在細菌定植及免疫反應中發揮重要作用，其中幾種已經鑒定為粘附素，與致病性相關。但由于膜蛋白的疏水性及表達量低等因素制約著結構研究的發展。近來，隨著分子生物學先進技術以及蛋白純化系統的應用，使得獲得大量活性蛋白質變得容易，這為蛋白晶體的生長提供了基礎。目前蛋白結晶技術迅速發展，大量新技術與結晶新產品廣泛使用，例如Hampton Research及Qiagen等公司不斷推出蛋白晶體生長條件篩選的試劑盒，建立了上千種不同篩選條件。脂立方相（LCP）法是逐漸發展起來的膜蛋白結晶方法，同時也產生了一系列立方相結晶試劑，確保全自動地、高通量膜蛋白結晶。蛋白結構的獲得不僅有助于理解單個蛋白作用的機制，對其作用配體篩選、免疫機理研究、抗菌藥物及疫苗的發展都具有重要的意義。

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R378．2

A

1002－2694（2012）02－0148－04

張建中，Email：zhangjianzhong＠icdc．cn

中國疾病預防控制中心傳染病預防控制所診斷室，北京102206

2011－10－17；

2011－11－25