豬輪狀病毒OSU株的培養特性與致病性研究＊

黃小波，徐 璐，曹三杰，文心田

豬輪狀病毒OSU株的培養特性與致病性研究＊

黃小波，徐 璐，曹三杰，文心田

目的開展豬輪狀病毒OSU株的細胞培養特性及致病性研究，確定輪狀病毒培養的關鍵技術與致病規律。方法以MA104細胞培養病毒，對預處理病毒的胰酶濃度與時間、維持液中最佳胰酶濃度等關鍵條件進行優化，透射電鏡觀察病毒粒子形態，測定病毒TCID50，口服感染3 d齡仔豬進行致病性試驗。結果病毒經20μg／m L胰酶預處理1 h，37℃吸附細胞2 h，維持液最佳胰酶濃度為4μg／m L，病毒典型細胞病變為病變細胞葡萄串狀堆積、胞漿相連、拉網等病變。透射電鏡下病毒粒子呈圓形車輪狀，直徑約80 nm。病毒感染3日齡仔豬10h后出現典型的黃色水樣腹瀉，感染42 h后死亡，剖檢可見胃內有凝乳塊、腸壁變薄充滿液體，盲腸、結腸充氣。主要病變為：腸上皮細胞變性、壞死、脫落；固有膜高度擴張、充血和伴有輕微出血；粘膜上皮脫落，粘膜下層水腫、炎性細胞浸潤等。結論研究闡明了輪狀病毒OSU株的培養特性與致病特征。

豬輪狀病毒；培養特性；人工感染；致病性

輪狀病毒（Rotavirus，RV）是引起幼兒和各種幼齡動物腹瀉的最常見病原之一，在世界范圍發生非常普遍。RV屬呼腸病毒（Reoviridae）科輪狀病毒屬，為雙鏈RNA病毒。豬輪狀病毒（PRV）是輪狀病毒引起的一種以腹瀉為特征的豬的傳染病，主要引起悉生豬和未食初乳的豬發生嚴重的胃腸炎和絨毛萎縮［1］。RV的分離培養條件非常苛刻，一直以來都是個難題，也是阻礙RV研究的主要原因。盡管最初分離的幾個輪狀病毒株如猴SA11株、牛Nebraska株和O株都易在細胞培養上增殖，但其他一些動物輪狀病毒如牛、豬和人的輪狀病毒培養時，通常不易成功或增殖率不高，或者不易傳代［2］。為探討豬輪狀病毒的細胞培養特性和致病性，本試驗以A群豬輪狀病毒OSU株為材料，對豬輪狀病毒的細胞培養關鍵技術、病毒增殖特性及病毒的人工感染致病性進行研究。

1 材料與方法

1．1 毒株與細胞 豬輪狀病毒OSU株，購自中國獸醫藥品監察所；恒河猴胚腎細胞（MA104），購自武漢大學中國典型培養物保藏中心。

1．2 試驗動物 3日齡未吃初乳的健康新生仔豬，由四川農業大學種豬場提供。

1．3 主要試劑與儀器 MEM（GIBCO），新西蘭新生牛血清（HyClone），胰蛋白酶（1∶250，GIBCO）購自成都金線科技有限公司；超純水儀；倒置顯微鏡，Olympus（ModelCK40－200）；Thermo Orion－Model868型p H儀；日立 H－600型透射電鏡；QUEUE型二氧化碳培養箱；SW－CJ－2FD型無菌操作工作臺等。

1．4 豬輪狀病毒的細胞增殖特性

1．4．1 細胞培養 用含10%新生牛血清和1%非必須氨基酸的 MEM（p H7．0）作為生長液培養MA104細胞，48 h長成良好致密單層即可用于傳代培養。

1．4．2 胰酶最佳濃度的篩選 在細胞培養維持液中加入不同濃度的胰酶（2、2．5、3、3．5、4、4．5、5μg／m L，待細胞長成單層后，不接種病毒，直接換加上述濃度的胰酶的細胞維持液，根據細胞的生長情況來優化篩選最佳的胰酶濃度，以培養24 h后有50%細胞單層未脫壁的胰酶濃度為最佳濃度。

1．4．3 病毒接種［3－5］病毒預處理，將病毒液與40 μg／mg胰酶1∶1混合，置于37℃溫育1 h。取生長狀態良好單層MA104細胞，棄去培養液，PBS液清洗3次，接種預處理的病毒混合液量0．5 m L，37℃，5%CO2培養箱中靜止培養2 h，每30 min搖晃1次，然后補足不含血清的 MEM（p H7．4）至10 m L。37℃，5%CO2培養箱中培養，逐日觀察細胞病變（CPE）情況，當CPE達90%時收取病毒液。

1．5 病毒粒子電鏡觀察［5］病毒細胞培養物反復凍融3次后，12 000 r／min離心20 min收集上清，45 000 r／min超速離心2 h，棄上清液。用少量PBS重懸沉淀，取10μL重懸液滴于銅網，然后用磷鎢酸染色，采用透射電鏡觀察病毒粒子形態。

1．6 病毒TCID50的測定 將處于對數生長期的細胞消化，制成細胞懸液，加入到96孔細胞培養板內，每孔加40μL，將病毒液作10倍梯度稀釋（10－1、10－2、10－3、10－4、10－5、10－6、10－7、10－8），然 后 每 孔 加 入40μL不同梯度的病毒液，每個梯度加15孔，并設一正常細胞生長對照孔。置37℃培養，逐日觀察記錄CPE，按照 Reed－Muech氏法計算病毒的TCID50值。

1．7 病毒的致病性試驗

1．7．1 人工感染試驗 選擇2頭健康新生仔豬，人工飼喂牛奶。試驗豬3日齡人工灌服1×106．8TCID50細胞病毒毒液2 m L，對照豬人工灌服正常對照細胞培養液2 m L，接種后逐日觀察試驗豬的癥狀。

1．7．2 病理變化觀察 對感染豬輪狀病毒后死亡仔豬進行剖解，觀察記錄剖檢肉眼病變，同時取空腸用10%福爾馬林固定，石蠟包埋切片，經HE染色，顯微鏡下觀察組織病變。

2 結 果

2．1 病毒的細胞增殖特性 正常MA104細胞呈扁平不規則的多邊形，中有2～3個胞核，培養48h即可長成致密細胞單層。初次接種輪狀病毒，不產生CPE，連續盲傳培養5代后開始出現CPE，病毒培養至第10代開始，CPE開始穩定而有規律。以細胞培養維持液中含有4μg／m L胰酶時CPE出現的時間最短，穩定的CPE主要表現為：細胞拉長變形，再逐漸變圓，折光性增強，隨后病變細胞出現葡萄狀堆積、胞漿相連、出現拉網變化，并伴隨著細胞空斑的形成。最后堆積細胞萎縮脫落，出現細胞融合現象，見圖1。

2．2 電鏡觀察 電鏡下可見典型的輪狀病毒顆粒，大小為80 nm左右，略呈圓形，具有雙層衣殼，見圖2。

圖1 輪狀病毒OSU株的細胞培養特性Fig．1 Cell culture characteristics of the rotavirus OSU strain A：The normal MA－104 cells，×200；B：Welling，glazing and accretion of infected MA104 cells after 18h infected with PRV．×200；C：Kytoplasm connecting，botryoidalis accretion of infected MA104 cells after 28h infected with PRV．×400；D：Net－balloon and lacuna of infected MA104 cells after 28h infected with PRV．×200

圖2 透射電鏡下的PRV病毒粒子（×17000）Fig．2 Virus pellets of PRV under electron microscope （×17000）

2．3 病毒TCID50測定結果 將病毒倍比稀釋后分別接種96孔細胞培養板，記錄出現細胞病變和沒有出現細胞病的孔數，統計結果見表1。由表中數據可看出，使半數細胞出現CPE的病毒稀釋倍數度（即 TCID50）介于10－6和10－7之間，然后根據Reed－Muech氏方法計算病毒的TCID50，稀釋倍數根據公式來計算：距離比＝（高于50%的百分數－50）／（高于50%的百分數－低于50%的百分數）＝（89．4－50）／（89．4－43．8）＝0．86；TCID50＝高于50%的病毒最高稀釋倍數的負對數＋距離比＝6＋0．86＝6．86。根據結果判定病毒的 TCID50為10－6．86／0．05 mL。

表1 病毒感染細胞的CPE的統計表Tab．1 Statistics of CPE after PRV infection

2．4 病毒的人工感染試驗結果

2．4．1 臨床癥狀 試驗仔豬接種病毒10 h后開始出現腹瀉，拉黃色水樣稀糞夾雜白色絮狀物。采集肛門糞便測定其p H值為6．0；接種病毒28 h后，仔豬精神變差，開始出現脫水，拉凝膠狀腹瀉物的次數增加，凝膠狀腹瀉物呈白色、黃色、深黃色的蛋花狀。接種病毒42 h仔豬死亡，死亡時脫水非常明顯，皮膚呈青紫色。整個試驗過程對照豬健康正常。

2．4．2 解剖病變 剖解見胃充氣，內有白色、黃色、綠色乳凝塊；空腸、回腸部分充氣，腸壁變薄，內有黃色內容物；盲腸、結腸腸壁變薄，充氣擴張，充滿黃色液體；膽囊充盈，見圖3。

圖3 輪狀病毒OSU株感染仔豬的癥狀與解剖病變Fig．3 Symptoms and lesions of piglets infected with rotavirus OSU strain A．piglet developed diarrhea by post inoculation（PI）10h；B．During post mortem，yellow fluid in thinner intestines and ectocolon were observed．；C．yellow，green and white ziega in gaster，D．cholecystis turgor

2．4．3 病理變化 空腸病理切片結果顯示，腸腔內有多量脫落的上皮細胞和炎性滲出物，并混有紅細胞；腸上皮細胞變性、壞死、脫落；腸固有膜毛細血管高度擴張、充血并伴輕微出血；嚴重者粘膜上皮大量脫落，裸露出固有膜；粘膜下層水腫、增厚，炎性細胞浸潤；肌層輕微水腫。

3 討 論

圖4 輪狀病毒OSU株感染仔豬的病理變化Fig．4 Pathological changes of piglets infected with rotavirus OSU strains A．cytonecrosis and exfoliation of enterocyte（HE 200×）；B．cytonecrosis and exfoliation of enterocyte（HE 400×）

3．1 豬輪狀病毒OSU株的細胞培養特性 豬輪狀病毒在豬群中感染非常普遍，在有腹瀉的豬群經常可以檢測到輪狀病毒的存在，該病常與冠狀病毒、大腸桿菌等混合感染而導致豬群嚴重的經濟損失。從臨床發病豬群的病料中分離輪狀病毒難度較大，一直制約著該病的深入研究，主要原因是輪狀病毒在細胞培養物上很難生長，目前除了A群輪狀病毒外，其他血清群的輪狀病毒的許多毒株迄今未能適應細胞培養，分離成功率約為40%～70%［6］，而A群輪狀病毒中僅有猴SA11株、牛Nebraska株和O株易于培養，牛、豬和人的輪狀病毒均難以在細胞上生長。豬輪狀病毒最初適應于經過胰蛋白酶或胰酶預處理的豬原代腎細胞［7］。后來Bohl等［8］在恒河猴胚腎細胞系MA－104上成功增殖了豬輪狀病毒。采用細胞培養增殖輪狀病毒需要用一定濃度的胰酶處理激活，而 胰 酶 濃 度 控 制 是 關 鍵［3，9］，Clark 等［10］認為輪狀病毒是通過胞漿膜直接進入胞漿，其穿入依賴于VP4，VP4需在胰酶作用下特異性裂解成VP5和VP8（60 k D，28 k D），從而使病毒獲得感染力。Yann等［11］證實胰酶能結合輪狀病毒顆粒，并溶解其外殼蛋白，而增強病毒感染性。大多數輪狀病毒在細胞培養物中增殖時，一般不產生細胞病變或只產生輕微而不穩定的細胞病變，且可能需要傳代幾次才能見到細胞致病作用。本研究采用MA－104細胞進行病毒培養，確定了最佳胰酶濃度，即首先采用終濃度為20μg／m L胰酶對病毒預處理1 h，維持液中添加4μg／m L胰酶為培養的最適條件。連續傳代7代后，出現穩定的細胞病變，一般在細胞培養18 h后產生明顯的細胞病變。細胞病變表現為細胞折光性增強、圓縮、葡萄串狀聚集，而后聚集細胞皺縮、脫落等特征。本研究還對病毒接種時吸附細胞單層的時間進行研究，即比較吸附1 h和2 h的效果，結果發現吸附2 h出現細胞病變時間更快，而且CPE程度也更高。本研究最終確定了培養豬輪狀病毒關鍵條件：采用MA－104細胞培養；病毒接種前用終濃度20μg／m L胰酶37℃預處理1 h，后吸附2 h；維持液中不加血清，添加4 ug／m L胰酶，在此條件下培養可獲得理想的病毒培養結果。

3．2 豬輪狀病毒OSU株的致病特性與發病機制

豬自然感染輪狀病毒常引起不太嚴重的臨床疾病或亞臨床疾病。對非免疫豬進行輪狀病毒接種試驗更能 表 現 輪 狀 病 毒 所 致 臨 床 疾 病 的 特 性［12－13］。Ciarlet等［14］認為A群輪狀病毒具有年齡依賴性，自然感染時常感染7～14 d齡仔豬或斷奶7 d內仔豬，人工感染1～5日齡仔豬癥狀最嚴重。本研究以A群的代表毒株OSU株感染3日齡初生仔豬，能引起嚴重的腹瀉癥狀，同時可引起小腸上皮細胞發生急性炎性反應，并使小腸絨毛發生變性、壞死、斷裂，從而引起仔豬發生嚴重的胃腸炎臨床癥狀。結果顯示OSU株對新生仔豬具有較強的致病性。

本研究構建了人工感染仔豬急性輪狀病毒的動物模型，觀察了豬輪狀病毒導致的發病過程。輪狀病毒進入動物體內后，主要在分化成熟的小腸絨毛上皮細胞的胞漿中進行復制［15］，并導致小腸絨毛上皮細胞功能減退、死亡；被感染的細胞發生溶解或脫皮，導致絨毛萎縮。絨毛萎縮的程度和萎縮的小腸絨毛在小腸內分布情況是決定臨床疾病嚴重程度的主要因素［16］。分化成熟的小腸細胞丟失而致小腸的消化吸收功能降低，從而使小腸內乳糖酶活性下降，進而導致乳糖在小腸腸腔內滯留，乳糖過多使小腸內容物滲透壓增高，引起滲透性腹瀉。由于豬群輪狀病毒的亞臨床感染相當普遍，從而表明豬輪狀病毒的致病機理中，其他因素如宿主、環境和其他病因等可能也起重要作用。

［1］Graham D Y，Sackman J W，Estes M K．Pathogenesis of rotavirus－induced diarrhea．Preliminary studies in miniature swine piglet［J］．Dig Dis Sci，1984，29（11）：1028－1035．．

［2］殷震，劉景華．動物病毒學［M］．北京：科學出版社，1997：562－571．

［3］陳淑紅，王新生，師東方，等．豬輪狀病毒的分離鑒定及部分特性研究［J］．中國預防獸醫學報，2004，（1）：42－44．

［4］Sanekata T，Kuwamoto Y，Akamatsu S，et al．Isolation of group B porcine rotavirus in cell culture［J］．J Clin Microbiol，1996，34（3）：759－61．

［5］洪濤．生物醫學超微結構與電子顯微鏡技術［M］．北京：北京科學出版社，1990：174－176．

［6］Saif L J，Terrett L A，Miller K L，et al．Serial propagation of porcine group C rotavirus（pararotavirus）in a continuous cell line and characterization of the passaged virus［J］．J Clin Microbiol，1988，26（7）：1277－1282．

［7］Theil K W，Bohl E H，Agnes A G．Cell culture propagation of porcine rotavirus（reovirus－like agent）［J］．Am J Vet Res，1977，38（11）：1765－1768．

［8］Bohl E H，Theil K W，Saif L J．Isolation and serotyping of porcine rotaviruses and antigenic comparison with other rotaviruses［J］．J Clin Microbiol，1984，19（2）：105－111．

［9］高運東，崔仁海，等．豬輪狀病毒的分離及弱毒株的培育［J］．山東農業科學，2002（3）：41－42．

［10］Clark SM，Roth JR，Clark ML，et al．Trypsin enhancement of rotavirus infectivity：mechanism of enhancement［J］．J Virol，1981，39（3）：816－822．

［11］Yann Benureau，Jean Claude Huet，Annie Charpilienne，et al．Trypsin is associated with the rotavirus capsid and is activated by solubilization of outer capsid proteins［J］．Journal of General Virology，2005，86：3143－3151．

［12］Crouch C F，Woode G N．Serial studies of virus multiplication and intestinal damage in gnotobiotic piglets infected with rotavirus［J］．J Med Microbiol，1978，11（3）：325－334．

［13］Narita M，Fukusho A，Konno S，et al．Intestinal changes in gnotobiotic piglets experimentally inoculated with porcine rotavirus［J］．Natl Inst Anim Health Q （Tokyo），1982，22（2）：54－60．

［14］Ciarlet M，Conner M E，Finegold M J，et al．Group A rotavirus infection and age－dependent diarrheal disease in rats：a new animal model to study the pathophysiology of rotavirus infection［J］．J Virol，2002，76（1）：41－57．

［15］Graham D Y，Estes M K．Pathogenesis and treatment of rotavirus diarrhea［J］．Gastroenterology，1991，101（4）：1140－1141．

［16］Saif L J，Ward L A，Yuan L，et al．The gnotobiotic piglet as a model for studies of disease pathogenesis and immunity to human rotaviruses［J］．Arch Virol Suppl，1996，12：153－161．

Culture characteristics and pathogenicity of porcine rotavirus OSU strain

HUANG Xiao－bo，XU Lu，CAO San－jie，WEN Xin－tian
（Laboratory of Animal Infectious Disease and Microarray；Key Laboratory of Animal Disease and Human Health of Sichuan Province，College of Veterinary Medicine，Sichuan Agricultural University，Ya′an 625014，China）

Porcine rotavirus was cultured successfully in MA－104 cells．The virus was treated for 1h by trypsin on final concentration of 20μg／m L，and then inoculated in maintain medium with 4μg／m L trypsin．The cytopathic effects such as kytoplasm connecting，botryoidalis accretion and net－balloon were clearly observed．Double capsid virus was detected by electron microscope．Healthy 3－day－old colostrums－deprived piglets were inoculated orally with 1×10（6．8）TCID50of porcine rotavirus．Piglets developed watery diarrhea 10h post infection，and died in 42h post infection．During necropsy，milk curd in stomach，fluid in thin walled small intestines，and ectocolon were observed．During his to pathological examination，slight to moderate villous stunting were observed．Bulging and sloughing of villous epithelial cells were prominent．Neutrophils were clustered in the lamina propria at villous tips subjacent to disrupted epithelium．In severity segment of villous destruction，necrosis and sloughing of exposed lamina propria resulted in complete loss of villous strcture．

porcine rotavirus；cell culture，；experimental infection；pathogenicity

R373

A

1002－2694（2012）02－0120－04

＊國家高技術研究發展計劃（863計劃）（2009AA10Z402）；國家農

業部公益性行業（農業）科研（201203056）；教育部《長江學者和創新團隊發展計劃》創新團隊項目（IRTO848）聯合資助

文心田，Email：xintian3211＠126．com

四川農業大學動物醫學院動物傳染病與基因芯片實驗室

動物疫病與人類健康四川省重點實驗室，雅安 625014

2011－09－25；

2011－11－12