家蠅幾丁質酶基因的序列分析、克隆和誘導表達＊

國 果，吳建偉，吳沁怡，付 萍，張 勇

幾丁質是構成大多數真菌細胞壁的主要成分，同時也廣泛存在于節肢動物外殼和軟體動物中。它不僅是昆蟲的重要結構組織，也是昆蟲防止機械損傷和生物危害的屏障。幾丁質酶（chitinase）是幾丁質降解酶系重要成員，屬于糖苷水解酶18家族GH18，能夠將幾丁質聚合物分解成殼糖乙糖苷和乙酰葡糖胺糖苷兩個部分［1］。該酶廣泛存在于各種真菌、植物、昆蟲和魚類等生物中。催化水解昆蟲幾丁質的酶主要是幾丁質酶，通過阻斷幾丁質酶，可以阻止昆蟲蛻皮和圍食膜再生，以達到殺滅昆蟲的目的［2－3］。因此，研究獲取昆蟲來源的幾丁質酶可以作為生物殺蟲劑來控制昆蟲和真菌病害。目前已克隆得到黑腹果蠅（Drosophila melanogaster）、岡比亞按蚊 （Anopheles gambiae）、赤擬谷盜（Tribolium castaneum）、家蠶（Bombyx mori）、埃及伊蚊（Aedes aegypti）等二十幾種昆蟲的幾丁質酶基因cDNA［4－6］。

家蠅（Musca domestica）是世界性分布的衛生昆蟲，從幼蟲到成蟲均生活在骯臟的環境中，是許多病原體的攜帶者，約60多種引起人類和動物疾病的病原體與家蠅有關，包括傷寒、霍亂、痢疾、肺結核及一些寄生蟲病等。目前對家蠅的研究主要是集中在抗菌肽方面［7］，對其幾丁質酶的研究尚未見報道。本研究克隆了家蠅幾丁質酶基因，并建立了體外表達系統，對其序列進行生物信息學的分析，為進一步研究家蠅幾丁質酶的酶學特性和有效利用奠定一定的基礎。

1 材料與方法

1．1 材料

1．1．1 文庫、菌種及質粒 家蠅三齡幼蟲全長cDNA質粒文庫的構建和EST測序及UniGene分析由北京華大合作完成。原核表達質粒pET 28a（＋）和大腸桿菌BL21（DE3）由中山大學引進本實驗室保存。

1．1．2 主要試劑及工具酶 Ex Taq酶（含dNTP），EcolⅠ、HindⅢ、T4DNA連接酶，DNA 標準（DL15，000，DL2，000）均購自大連寶生物工程公司；異丙硫代β－D半乳糖苷（IPTG）購自美國Promega公司；DNA凝膠回收試劑盒、質粒純化試劑盒購自廣州鉑爾生物。

1．1．3 引物合成和DNA測序 基因擴增引物合成和重組質粒DNA測序由Invitrogen上海生物技術有限公司完成。

1．2 方法

1．2．1 家蠅幾丁質酶基因Ⅰ（MDCⅠ）的識別及序列測定 對測定得到的家蠅三齡幼蟲EST序列進行BLASTX分析，從中篩選獲得編碼家蠅幾丁質酶基因的文庫質粒（編號為005－C09），命名為MDCⅠ。

1．1．2 MDCⅠ 基因的生物信息學分析 利用瑞士生物信息學研究所的蛋白分析專家系統（Expert Protein Analysis System，ExPASy）提供的生物信息學工具，分析預測蛋白質的理化性質、修飾位點、信號肽、跨膜區及二級結構等。

1．2．3 MDCⅠ 基因的擴增 根據已獲得的MDCⅠ編碼序列，利用DNA Club和Primer5．0設計引物。上游引物：5′GCCGAATTCTTTCTAGTGGTATGGCAGCAG 3′帶EcoRⅠ酶切位點；下游引物：5′GCGAAGCTTTCTGTTGGAATGATCAGT GG 3′，帶HindⅢ酶切位點。

以家蠅三齡幼蟲cDNA文庫中MDCⅠ基因的質粒為模板，94℃預變性5min后，熱循環參數為94℃1min，59℃1min，72℃1min，共35個循環，最后72℃延伸10min。PCR產物1%瓊脂糖凝膠電泳回收。

1．2．4 重組原核表達質粒（pET 28a（＋）－MDCⅠ）的構建及鑒定 將PCR產物和原核表達質粒pET 28a（＋）經EcoRⅠ、HindⅢ 雙酶切后回收，連接并轉化大腸桿菌BL 21／DE3感受態細胞，卡那霉素篩選陽性克隆，對陽性克隆提取質粒進行PCR，雙酶切和測序鑒定。

1．2．5 MDCⅠ基因在大腸桿菌BL 21／DE3中的誘導表達 取50μL培養過夜的陽性克隆菌液，加入含有卡那霉素的5mL LB培養基中（菌液／培養基為1／100），37℃220r／min振搖至 OD600＝0．4～0．6時，加入IPTG至終濃度1mmol／L，誘導表達5h。離心收集菌體，在沉淀中加入100μL 1×SDS－PAGE上樣緩沖液，煮沸5min，13000r／min離心1min取上清10μL進行SDS－PAGE電泳分析。

2 結 果

2．1 序列分析 MDCⅠ基因與果蠅的同源基因氨基酸序列的一致性可達60%～70%，ORF全長753bp，編碼251個氨基酸（圖1），預測分子量為28．63kDa，理論等電點（pI值）5．78。含有3個半胱氨酸，在溶液中性質穩定。

MotifScan（模序）分析顯示，該蛋白含有1個N－糖基化位點，3個N－肉豆蔻酰化位點，6個蛋白激酶C磷酸化位點及1個幾丁質酶的活性位點；由Signal P 3．0預測N端含有23個氨基酸殘基的信號肽；PredictProtein分析蛋白的拓撲結構和二級結構顯示，MDCⅠ蛋白有一個跨膜區位于aa6－aa16，Sec預測α螺旋（H）、β折疊（E）和無規則卷曲（L）的比例是：29．54：17．79：52．67，以無規則卷曲為主。

BLAST對其保守結構域分析顯示，MDCⅠ中含有幾丁質酶的保守結構域和活性位點，屬于糖苷水解酶18家族（圖2）。

圖1 家蠅幾丁質酶基因Ⅰ開放閱讀框cDNA序列及對應編碼的氨基酸序列Fig．1 Full－length cDNA sequence of MDCⅠand the amino acid sequence encoded by the ORF

2．2 MDCⅠ基因擴增及原核重組質粒的鑒定MDCⅠ基因經PCR擴增后，獲得了800bp左右的特異條帶（圖3泳道1）。將重組質粒進行雙酶切鑒定，產物進行1%瓊脂糖凝膠電泳。電泳結果顯示（圖3泳道3）：重組質粒雙酶切后，在800bp左右有一清晰的條帶，與目的基因的大小基本相符，提示重組質粒構建成功。將挑選的陽性克隆子送Invitrogen公司，進一步以pET 28a（＋）的通用引物對重組質粒測序，結果表明相應的插入序列與目的基因cDNA序列一致，證明MDCⅠ基因原核表達重組質粒構建成功。

2．3 目的基因表達產物的SDS－PAGE鑒定 取重組菌誘導前后的表達產物進行SDS－PAGE，結果發現誘導的重組菌約在32kDa左右出現表達條帶，與目的蛋白預測的分子量（28．63kDa）加上所帶His標簽分子量（約3kDa）基本相符，而未誘導菌無此條帶（圖4）。

圖2 GenBank中MDCⅠ功能域分析Fig．2 Functional domain analysis of MDCⅠin GenBank

圖3 重組質粒的雙酶切鑒定圖Fig．3 Identification of pET 28a（＋）－MDCⅠby PCR amplification and restriction enzymes digestionM：DNA Marker DL 2000；1：PCR product of MDCⅠamplified from cDNA library of Musca domestica；2：pET 28a（＋）digested by restriction enzymes EcoRⅠand HindⅢ；3：pET 28a（＋）－MDCⅠdigested by restriction enzymes EcoRⅠand HindⅢ

3 討 論

圖4 重組質粒pET 28a（＋）－MDCⅠ在大腸桿菌的表達產物SDS－PAGE電泳分析1：蛋白質分子量標準；2、3：IPTG誘導的表達產物；4、5：未誘導的表達產物箭頭所指為目標蛋白Fig．4 SDS－PAGE analysis on prokaryotic expression product of pET 28a（＋）－MDCⅠM，1：Protein marker；2，3：BL21cell containing IPTG induced pET 28a（＋） －MDCⅠ；4，5：BL21 cell containing uninduced pET 28a（＋）－MDCⅠ

一種昆蟲體內幾丁質酶基因有1個還是多個在很長時間內存在爭議，隨著昆蟲基因組測序的完成，Zhu Q等2004年首次報道在果蠅中有多個幾丁質酶基因［8］。我課題組在對家蠅EST序列分析的過程中，也發現了家蠅體內至少存在兩個幾丁質酶基因，本研究選取了其中一個基因進行序列分析及克隆表達（另一個基因另文報道），命名為 MDCⅠ。MDCⅠ基因序列包含完整的開放閱讀框，為全長cDNA序列。序列分析顯示，該酶具有典型的幾丁質酶結構特征，從N端到C端依次含有信號肽、幾丁質酶活性中心，編碼的氨基酸序列與18家族昆蟲幾丁質酶有較高的相似性。一般認為，昆蟲幾丁質酶分子量在40～85kDa之間，比植物幾丁質酶（25～40kDa）和細菌幾丁質酶（20～60kDa）大［9］，而我們得到的MDCⅠ預測的蛋白分子量為28kDa左右，表達出的蛋白經SDS－PAGE電泳也證實了其分子量與預測的分子量基本相符，提示家蠅幾丁質酶分子量較其他昆蟲的小。

本研究將家蠅幾丁質酶基因片段克隆到原核表達載體pET 28a（＋）中，構建重組質粒pET 28a（＋）／MDCⅠ，所獲得的重組質粒經過酶切、PCR和測序鑒定，證實含有目的基因片段，且連接、構建正確。重組質粒轉化入大腸桿菌BL 21／DE3，IPTG誘導表達，電泳顯示重組蛋白條帶非常清晰，表明重組蛋白得到了高效表達，本實驗結果為進一步研究MDCⅠ的生物學活性及表達模式奠定了基礎。

［1］Dahiya N，Tewari R，Hoondal GS．Biotechnological aspects of chitinolytic enzymes：a review［J］．Appl Microbiol Biotechnol．2006，71（6）：773－782．DOI：10．1007／s00253－005－0183－7

［2］Liu MY，Zhang HB，Hu XQ，et al．Purification and characterization of a chitinase from Bombyx mori［J］．Chin J Biotech，2010，26（3）：404－409．（in Chinese）劉明艷，張洪斌，胡雪芹，等．昆蟲來源的幾丁質酶的分離純化及酶學性質［J］．生物工程學報，2010，26（3）：404－409．

［3］Tian H，Peng H，Yao Q，et al．Developmental control of a lepi－dopteran pest Spodoptera exigua by ingestion of bacteria expressing dsRNA of a non－midgut gene［J］．PloS One，2009，4（7）：e6225．DOI：10．1371／journal．pone．0006225

［4］Bolognesi R，Arakane Y，Muthukrishnan S，et al．Sequences of cDNAs and expression of genes encoding chitin synthase and chitinase in the midgut of Spodoptera frugiperdaInsect［J］．Insect Biochem Mol Biol，2005，35（11）：1249－1259．DOI：10．1016／j．ibmb．2005．06．006

［5］Daimon T，Hamada K，Mita K，et al．A Bombyx mori gene，BmChi－h，encodes a protein homologous to bacterial and baculovirus chitinases［J］．Insect Biochem Mol Biol，2003，33（8）：749－759．DOI：10．1016／S0965－1748（03）00084－5

［6］Genta FA，Blanes L，Cristofoletti PT，et al．Purification，characterization and molecular cloning of the major chitinase from Tenebrio molitor larval midgut［J］．Insect Biochem Mol Biol，2006，36（10）：789－800．DOI：10．1016／j．ibmb．2006．07．007

［7］Jin XB，Zhu JY，Ma Y，et al．The expression of anti－bacterial peptide cecropin gene in COS－7cells and the preliminary study on the activities of its gene product［J］．Chin J Zoonoses，2007，23（6）：566－568．（in Chinese）金小寶，朱家勇，馬艷，等．家蠅抗菌肽基因Cecropin在COS－7細胞中的表達及產物活性初步研究［J］．中國人獸共患病學報，2007，23（6）：566－568．

［8］Zhu Q，Deng Y，Vanka P，et al．Computational identification of novel chitinase－like proteins in the Drosophila melanogaster genome［J］．Bioinformatics，2004，20（2）：161－169．DOI：10．1093／bioinformatics／bth020

［9］Zhang FL，Wang ZY，Wang ZB，et al．Insect chitinases and their application prospects in plant pest control［J］．For Pest Dis，2007，26（4）：22－25．（in Chinese）張福麗，王志英，王占斌，等．昆蟲幾丁質酶及其在植物害蟲防治中的應用前景［J］．中國森林病蟲，2007，26（4）：22－25．