51例新生兒臍帶血單純皰疹病毒的檢測

任鵬，姚娟，金艷，李法錦，汪曉婷，葛俊，江龍鳳，趙蕾，吉陽，王明麗

1. 安徽醫(yī)科大學(xué)微生物學(xué)教研室，合肥 230032； 2. 合肥市婦幼保健院，合肥 230001

單純皰疹病毒(herpes simplex virus，HSV)屬α皰疹病毒，直徑110～120 nm，基因組為雙鏈DNA，約150 kb。根據(jù)血清型，分為HSV-1和HSV-2，兩者均可引起新生兒感染。孕早期感染HSV者因胚芽受破壞而流產(chǎn)；妊娠中、晚期感染者雖少發(fā)畸胎，但可引起胎兒和新生兒發(fā)病。孕期2種感染形式均可影響胎兒，特別是孕早期和分娩時(shí)首次感染可通過胎盤傳播給胎兒。妊娠前20周首次感染可導(dǎo)致自然流產(chǎn)、死產(chǎn)和胎兒先天性畸形，特別是小頭畸形、腦積水；妊娠中、晚期首次感染主要導(dǎo)致胎兒宮內(nèi)發(fā)育遲緩[1]。因此，了解新生兒HSV感染情況，對指導(dǎo)新生兒HSV感染所致疾病的預(yù)防和治療具有重要意義。本研究采集了合肥地區(qū)51例新生兒臍帶血，通過套式聚合酶鏈反應(yīng)(polymerase chain reaction，PCR)檢測特異性HSV-1 gD基因和HSV-2 gG基因。PCR陽性擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)測序后，通過美國國立生物技術(shù)信息中心(National Center for Biotechnology Information，NCBI)在線工具BLAST進(jìn)行序列比對，確認(rèn)HSV-1、HSV-2陽性標(biāo)本，分析51例新生兒臍帶血HSV感染情況。

1 材料和方法

1.1 研究對象

2010年11月～2011年6月，于某地婦幼保健院采集健康產(chǎn)婦順產(chǎn)新生兒抗凝臍帶血51份。

1.2 病毒株

HSV-1(F株)、HSV-2(Sav株)標(biāo)準(zhǔn)株[2]均為本室保存，用作陽性對照。

1.3 儀器和試劑

全血DNA抽提試劑盒購自北京索萊寶公司；DNA IQTMSystem-Small Sample Casework Protocol試劑盒購自Promega公司；試劑購自TaKaRa公司；梯度PCR儀為Biometra 公司產(chǎn)品。應(yīng)用Gel Documentation System (Biosens SC 720)凝膠成像系統(tǒng)觀察記錄結(jié)果。引物合成和DNA測序均由上海Invitrogen公司完成。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1標(biāo)本采集新生兒臍帶血無菌采自臍帶近嬰兒段，用醫(yī)用無菌肝素抗凝管收集，每管3 ml。采集后，冰盒送實(shí)驗(yàn)室用于檢測。

1.4.2DNA提取應(yīng)用北京索萊寶公司全血DNA抽提試劑盒提取新生兒臍帶血DNA，-20 ℃保存。抽提方法為DNA柱吸附洗脫法，操作按試劑盒詳細(xì)說明進(jìn)行。

1.4.3套式PCR檢測新生兒臍帶血HSVDNA特異性HSV-1 gD基因和HSV-2 gG基因套式PCR引物參考Lewensohn-Fuchs等[3]設(shè)計(jì)及使用(表1)。PCR反應(yīng)體系為：10×Buffer 5 μl，2.5 mmol/L dNTP 4 μl，上下游引物80 pmol，Taq酶0.5 μl，DNA模板2 μl，用無菌去離子水補(bǔ)足50 μl。每次實(shí)驗(yàn)均設(shè)陰性對照(不加模板)。反應(yīng)體系的配制、分裝在超凈工作臺內(nèi)進(jìn)行。HSV套式PCR反應(yīng)條件均為94 ℃預(yù)變性5 min、94 ℃變性30 s、57 ℃退火30 s、72 ℃延伸30 s、72 ℃終延伸10 min，外側(cè)引物PCR 30個(gè)循環(huán)，內(nèi)側(cè)引物PCR 35個(gè)循環(huán)。PCR反應(yīng)完成后，取5 μl產(chǎn)物用于2%瓊脂糖凝膠電泳，并通過凝膠成像系統(tǒng)觀察記錄。陽性擴(kuò)增產(chǎn)物測序后，通過NCBI在線工具BLAST進(jìn)行序列比對。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

使用SPSS 17.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)數(shù)資料采用χ2檢驗(yàn),P<0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表1 HSV套式PCR引物序列Tab.1 HSV nested-PCR primers

2 結(jié)果

2.1 新生兒臍帶血HSV-1和HSV-2的檢測

采集健康產(chǎn)婦順產(chǎn)新生兒抗凝臍帶血51份，應(yīng)用HSV-1 gD基因特異性套式PCR引物檢測標(biāo)本，其中擴(kuò)增陽性標(biāo)本12份(圖1A)。經(jīng)測序并比對，發(fā)現(xiàn)擴(kuò)增產(chǎn)物大小與引物設(shè)計(jì)大小一致，且均為HSV-1特異性產(chǎn)物。因此，51份臍帶血標(biāo)本中，HSV-1陽性率為23.53%，表明HSV-1感染率為23.53%(表2)。 應(yīng)用HSV-2 gG基因特異性套式PCR引物檢測51份臍帶血標(biāo)本，其中擴(kuò)增陽性標(biāo)本13份(圖1B)。經(jīng)測序并比對，發(fā)現(xiàn)擴(kuò)增產(chǎn)物大小與引物設(shè)計(jì)大小一致，且均為HSV-2特異性產(chǎn)物。因此，51份臍帶血標(biāo)本中，HSV-2陽性率為25.49%，表明HSV-2感染率為25.49%。51份標(biāo)本中，HSV-1和HSV-2共陽性標(biāo)本4份，共感染率為7.84%。

M: marker DL2000; Lane 1: positive control; Lanes 2-7 specimens; Lane 8: negative control.

表2 新生兒臍帶血HSV-1和HSV-2的檢測Tab.2 Detection of HSV-1 and HSV-2 in neonatal cord blood

2.2 新生兒臍帶血HSV-1和HSV-2感染率比較

51例新生兒臍帶血HSV-2感染率略高于HSV-1，無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(表3)。

表3 51例新生兒臍帶血中HSV-1和HSV-2檢出率的比較Tab.3 Comparison of detection rate of HSV-1 and HSV-2 in neonatal cord blood

3 討論

HSV先天性感染是導(dǎo)致新生兒出生缺陷的重要因素之一。有學(xué)者總結(jié)了30例先天性HSV感染患兒的臨床特征，其中85%為低出生體重兒，36%為小于胎齡兒，67%有小頭畸形、驚厥、彌散性腦損害、顱內(nèi)鈣化灶，57%有脈絡(luò)膜視網(wǎng)膜炎、眼過小[3]。

新生兒HSV感染后早期臨床表現(xiàn)多不典型，易誤診而延誤治療，因此實(shí)驗(yàn)室檢測具有重要的診斷參考價(jià)值[4]。實(shí)驗(yàn)室診斷主要技術(shù)為病毒分離、培養(yǎng)及鑒定、PCR檢測病原體DNA，以及特異性抗體檢測。病毒分離、培養(yǎng)是實(shí)驗(yàn)室診斷的“金標(biāo)準(zhǔn)”，但耗時(shí)長，作為臨床快速檢測方法有一定缺陷。HSV特異性抗體檢測可診斷新生兒HSV感染，但血清HSV IgG及IgM 抗體檢測存在以下問題。(1)母親經(jīng)胎盤傳遞的IgG抗體影響結(jié)果判斷。(2)特異性HSV IgM抗體在發(fā)病后2周才產(chǎn)生，達(dá)不到早期診斷的目的[5,6]。目前，PCR廣泛應(yīng)用于病原學(xué)檢測，已成功用于腦脊液和血液中HSV DNA的檢測[7]，使早期確診、及時(shí)治療成為可能。PCR擴(kuò)增標(biāo)本中的HSV DNA并測序，可確定標(biāo)本中是否有HSV，是一種比較準(zhǔn)確、有效的方法[8]。但在操作過程中易污染，結(jié)果需慎重對待。

HSV-1 US6編碼gD糖蛋白。gD糖蛋白能與HveA、nectin 1和修飾后的硫酸肝素這3種細(xì)胞受體結(jié)合，從而決定病毒的細(xì)胞嗜性。HSV-2 US4編碼gG糖蛋白。gG糖蛋白為屬特異性糖蛋白，其抗體可用于HSV分型。HSV-1 gD基因和HSV-2 gG基因均為病毒晚期基因，在病毒DNA復(fù)制起始后，表達(dá)水平顯著升高[9]，檢測到晚期基因表達(dá)即可判斷病毒感染為活動(dòng)性感染。因此，本研究分別選擇HSV-1gD基因和HSV-2gG基因作為套式PCR檢測的病毒基因。

新生兒HSV感染的獲得途徑主要有3種：宮內(nèi)感染、產(chǎn)時(shí)感染和產(chǎn)后感染[10]。在胎兒生長、發(fā)育過程中，物質(zhì)通過胎盤進(jìn)行交換，為胎兒生長、發(fā)育提供支持。胎盤內(nèi)有母體和胎兒2套血液循環(huán)系統(tǒng)。母體動(dòng)脈血經(jīng)子宮螺旋動(dòng)脈流入絨毛間隙，在此與絨毛內(nèi)血管的胎兒血進(jìn)行交換后，經(jīng)子宮靜脈流回母體。胎兒靜脈血經(jīng)臍動(dòng)脈及其分支流入絨毛毛細(xì)血管，與絨毛間隙內(nèi)的母體血進(jìn)行物質(zhì)交換后，經(jīng)臍靜脈回流至胎兒。母體和胎兒的血液在各自封閉管道內(nèi)循環(huán)，進(jìn)行物質(zhì)交換，但互不相混。因此一般認(rèn)為，臍帶血檢測能直接、準(zhǔn)確反映新生兒血液中是否存在HSV；如檢測到HSV，可認(rèn)為新生兒HSV感染可能為垂直傳播[11,12]。

O’Riordan和Whitley等報(bào)道，美國新生兒HSV感染的發(fā)病率高，占新生嬰兒的1/5 000～1/3 500，每年大約有1 500名新生兒感染HSV。其他國家發(fā)病率略低，英國為1/6 500，瑞典為1/15 000，日本為1/17 000[13,14]。Brown等通過HSV分離方法檢測202例新生兒，報(bào)道新生兒HSV感染率為5%(10/202)[15]。Kropp和Whitley等報(bào)道新生兒HSV宮內(nèi)感染率為5%～9%[16,17]。Shyamala等報(bào)道在先天性白內(nèi)障新生兒中HSV感染率為18%[18]。

本次研究發(fā)現(xiàn) 51份臍帶血中HSV-1陽性12份，感染率23.53%；HSV-2陽性13份，感染率25.49%；HSV-1和HSV-2共陽性4份，共感染率7.84%。

本研究中，新生兒HSV感染率高于國外報(bào)道，可能原因如下。(1)標(biāo)本例數(shù)過少和地域差異，需在以后工作中擴(kuò)大篩查量。(2)套式PCR反應(yīng)較敏感，且標(biāo)本采集時(shí)如不謹(jǐn)慎操作可導(dǎo)致標(biāo)本污染，有可能出現(xiàn)假陽性。因此，在以后工作中，除應(yīng)增加標(biāo)本量外，還應(yīng)對新生兒及產(chǎn)婦進(jìn)行HSV特異性抗體檢測，以分析獲得新生兒HSV感染率的準(zhǔn)確數(shù)據(jù)。鑒于我國尚無針對新生兒HSV先天感染率的準(zhǔn)確數(shù)據(jù)報(bào)道，本研究有利于提高臨床工作者對新生兒HSV感染疾病預(yù)防和治療的重視度，開展調(diào)查及加強(qiáng)早期診斷和治療。

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