隱球菌形態學變化及其致病機制

潘搏，陳敏，潘煒華，廖萬清

上海長征醫院皮膚病與真菌病研究所/上海市醫學真菌分子生物學重點實驗室/全軍真菌與真菌病重點實驗室/第二軍醫大學附屬長征醫院皮膚科，上海 200003

致病真菌在與宿主相互作用過程中會發生形態學改變，如白假絲酵母在不同感染階段會產生假菌絲和真菌絲，這種形態學變化與真菌的組織嗜性和系統播散有密切關系。菌絲形態可增強真菌在組織中的侵襲性，酵母形態則有助于真菌通過血液和淋巴系統形成系統播散[1]。而雙相型真菌如組織胞漿菌和皮炎芽生菌表現出溫度介導的形態變化，在體外環境中表現為菌絲態，在人體37 ℃體溫下表現為酵母相。

隱球菌病是由隱球菌引起的一種嚴重深部真菌病，世界各地均有流行，每年約造成62萬人死亡。常見的致病隱球菌主要有新生隱球菌(Cryptococcusneoformans)和格特隱球菌(Cryptococcusgattii)，其他少見的致病菌包括羅倫隱球菌和淺白隱球菌。中樞神經系統、肺和皮膚是該病的常見感染部位。與其他真菌相比，隱球菌菌體外周有莢膜包繞，這是其最顯著的形態學特征，也是直接通過腦脊液墨汁染色診斷該病的原因之一。同時，莢膜是隱球菌的主要毒力因子，會隨著所處環境的不同發生結構變化，這有利于隱球菌適應環境壓力。此外，隱球菌孢子(spore)形成和巨大菌體的變化與該病的發生也有密切關系。本文就隱球菌的形態學變化與其致病機制的關系進行綜述。

1 孢子形成與吸入感染

目前認為，隱球菌的自然感染途徑主要是呼吸道吸入方式。在宿主免疫缺陷時，被吸入的隱球菌無法被免疫細胞清除，隨之播散到其他組織器官，包括中樞神經系統[2]。環境中干燥的隱球菌和隱球菌孢子被認為是可能吸入的病原菌原型。但干燥的隱球菌(直徑3 μm)易在環境播散過程中死亡，而隱球菌孢子(直徑1～2 μm)有更好的環境適應能力，更易在外界環境中存活和被宿主吸入[3-5]。

隱球菌孢子可通過2種不同途徑生成，即有性交配(sexual development)和單核體結實(monokaryotic fruiting)。有性交配過程是隱球菌α和a交配型(MATα和MATa)的單倍體細胞在合適外界環境中發生融合，產生菌絲，其末端菌絲細胞分化為擔子，經核融合和減數分裂在擔子表面產生孢子長鏈[6]。這種有性生殖方式更有利于2種交配型孢子的產生和播散[6]。而單核體結實則發生在外界營養匱乏的情況下，即使沒有MATa交配型，2株MATα間也可發生同性交配，細胞融合生成單核菌絲，再通過減數分裂產生重組擔孢子[7]。1999年至今在溫哥華島暴發流行的隱球菌病多累及免疫力正常的宿主，對致病菌交配型位點基因分析發現，主要致病株VGⅡa亞型隱球菌由MATα交配型的格特隱球菌同性交配產生。有學者認為，這種單核產物的生殖方式可能會增強隱球菌的毒力[8]。

由于既往缺乏分離隱球菌孢子的手段，沒有對這種有性孢子進行深入研究。隨著顯微解剖技術(microdissection)和密度梯度離心方法的出現，為研究該菌孢子生理、生化特性和模擬自然感染過程提供了可能[3,5]。電子顯微鏡下隱球菌孢子有很厚的孢壁(spore coat)，而干燥隱球菌沒有該結構[3]。孢壁使孢子擁有很強的抵抗外界傷害的能力。與干燥酵母細胞相比，它更能抵御干燥、高溫的環境[3]。

隱球菌吸入感染小鼠模型顯示，500個新生隱球菌孢子足以造成致死性感染[5]。但與吸入酵母樣菌體的小鼠相比，吸入孢子的小鼠在感染3 d和6 d后肺內菌體量明顯減少，說明隱球菌孢子可能更容易被免疫細胞吞噬[4]。孢子與小鼠巨噬細胞共孵育的實驗也顯示，這種孢子更容易被巨噬細胞吞噬，且這種吞噬作用不依賴調理素(opsonin)介導[4,5]。進一步研究發現，這種吞噬孢子的作用由隱球菌孢子β-1,3-葡聚糖、巨噬細胞dectin 1受體和白細胞黏附分子CD11b所介導[4]。雖然巨噬細胞的吞噬作用可殺滅病原菌，但在缺少脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)和γ干擾素(interferon γ, IFN-γ)活化巨噬細胞的情況下，部分被吞噬的孢子可在巨噬細胞內萌發(germination)和增殖。在上述2種物質活化巨噬細胞的情況下，胞內隱球菌孢子被快速殺滅，這種殺傷作用依賴于巨噬細胞內活性氧和活性氮(reactive oxygen and nitrogen)[4]。而孢子萌發后形成的酵母樣細胞可抵抗上述2種物質的殺傷[9]。越來越多的證據顯示，隱球菌在巨噬細胞內生存與其在宿主體內播散、致病有密切關系[10,11]。

隱球菌孢子易被巨噬細胞吞噬和殺滅與其在動物模型中的致病能力相互矛盾。Botts等提出一種動態模型(kinetic model)來解釋這種“矛盾”。他們認為，盡管巨噬細胞活化使大多數胞內孢子被殺滅，但少數未經活化的巨噬細胞內孢子暫時逃避了這種殺傷作用[9]。這些未被殺滅的孢子在巨噬細胞活化并萌發，形成能抵抗巨噬細胞殺傷的酵母樣細胞并將巨噬細胞作為“特洛伊木馬”(Trojan horse)造成全身播散[10]。在該動態模型中，巨噬細胞活化是隱球菌孢子能否致病的關鍵所在。免疫功能正常的宿主可及時殺死和清除胞內的萌發孢子，使宿主免于感染；而免疫功能受損的宿主無法在孢子萌發“窗口期”(window of germination)內激活初始免疫反應而及時殺傷孢子，使孢子萌發形成可抵抗巨噬細胞殺傷作用的酵母樣細胞[9]。如獲得性免疫缺陷綜合征(acquired immunodeficiency syndrom，AIDS)患者體內CD4+T細胞和肺泡巨噬細胞因受病毒感染，天然免疫反應低下或延遲，從而成為易感人群[12]。

由于肺泡巨噬細胞是隱球菌侵入宿主所面臨的第1道防線，隱球菌突破該防線的過程等同于孢子萌發與宿主天然免疫“賽跑”的過程，其結果決定了吸入肺內的隱球菌是被宿主清除還是在胞內存活及致病。

2 莢膜變化與環境適應

如前所述，菌體外包繞的厚壁莢膜是隱球菌最顯著的形態學特征。隱球菌的莢膜主要由葡糖醛木甘聚糖(glucuronoxylomannan, GXM)、半乳木糖甘露聚糖(galactoxylomannan, GalXM)和甘露糖蛋白(mannoprotein)組成。不同血清型的隱球菌莢膜GXM成分及總木糖、甘露糖和葡萄糖醛酸摩爾比值不同。

研究發現，與野生株相比，隱球菌莢膜基因缺陷的菌株感染能力下降。莢膜大小與生長環境有密切關系，標準培養基和外界環境中隱球菌莢膜較小，而宿主肺泡內和巨噬細胞內隱球菌莢膜體積明顯增大[13,14]。體外實驗發現，環境中CO2濃度升高、鐵離子濃度降低、營養匱乏時，莢膜會顯著增大。另外，環境滲透壓、pH值和二價離子濃度變化也會影響莢膜體積[15]。最新研究發現，隱球菌與巨噬細胞和阿米巴原蟲共孵育時會導致莢膜變大，此過程由共孵育細胞的磷脂類物質介導，這是首次發現能介導隱球菌莢膜變化的宿主自身分子[16]。

Zaragoza等用補體標記莢膜和放射性氚標記甘露糖的方法研究了莢膜增大的動態變化，發現在莢膜增大過程中原有莢膜位置不變，仍緊貼細胞壁，在其外側產生新生莢膜[17]。動態光散射技術揭示了莢膜增大的分子機制，發現隱球菌生成的莢膜多糖(包括GXM和GalXM)分子的有效直徑(effective diameter)與莢膜直徑呈線性關系，莢膜變大的過程也是上述多糖分子有效直徑變化的過程[18]。

隱球菌胞壁外的莢膜、脫落至宿主內環境中的莢膜和吞噬細胞內脫落的莢膜可通過多種機制保護隱球菌免受宿主殺傷。巨噬細胞的吞噬和殺傷作用是天然免疫過程中至關重要的環節。已有研究發現，隱球菌莢膜體積與抗體和補體介導的巨噬細胞吞噬作用呈負相關。即莢膜越大，越不易被吞噬[19]；且莢膜增大后，內層原有莢膜密度增大，可明顯減少外源性物質的滲透[17]。此外，在培養基和宿主體內均發現隱球菌存在莢膜脫落現象，這種脫落至宿主內環境中的莢膜多糖與隱球菌胞壁外的莢膜成分和性質均不同[20]。脫落的莢膜可調節宿主免疫功能，如這些莢膜中的GXM和GalXM可誘導巨噬細胞和T細胞凋亡[21]。在巨噬細胞內生存、增殖有助于隱球菌逃避宿主免疫和抗真菌藥物的殺傷作用。但巨噬細胞內環境惡劣，隱球菌需要表達一系列毒力因子來適應細胞內環境。實驗證明，隱球菌被巨噬細胞吞噬后莢膜體積顯著增大，增大的莢膜可幫助其抵御巨噬細胞內氮、氧自由基的殺傷作用，這種抵抗殺傷的作用與莢膜大小成正比[14]。

由此可見，隱球菌莢膜體積的變化與外界環境息息相關。增大的莢膜可通過自身體積增大和結構變化增強隱球菌抵御外界不利生存環境的能力。

3 巨大菌體與潛伏感染

在宿主體內，除可觀察到隱球菌莢膜的形態學變化，還可見菌體變大的現象。這種變大的菌體體積(不包括莢膜)是酵母樣隱球菌的5～10倍。另外，大菌體隱球菌還表現出細胞壁增厚、染色體數目增加和抗氧化損傷的特性，所以有學者將其稱為“titan cell”[22]。其實，先前就有學者在隱球菌患者的肺、腦和腦膜組織中發現這種巨型隱球菌，菌體直徑可達25～30 μm，而體外培養的酵母樣隱球菌的菌體平均直徑為4.5 μm，但當時未對其產生原因進行深入研究[13,23]。

最近2項研究通過分析經呼吸道感染小鼠肺組織中的巨型隱球菌，揭示了這種形態學變化在隱球菌致病過程中的作用[22,24]。Zaragoza等發現，經呼吸道感染的免疫力正常小鼠，肺組織中巨大菌體占所有隱球菌的10%～80%，且肺內隱球菌接種量的多少與巨型隱球菌產生比例成反比[24]。Okagaki等發現，小鼠經呼吸道接種隱球菌3 d后，肺組織中菌體直徑>10 μm的隱球菌約占20%，部分菌體直徑甚至達到50～100 μm(不包括莢膜)[22]。將這種巨大菌體的隱球菌置于體外培養基培養時，它仍保持自身巨大形態，但可通過出芽、生殖，快速產生小的酵母樣子代隱球菌[24]。同時，這2項研究發現巨型隱球菌是單核多倍體(四倍體或八倍體)，DNA含量和染色體數目較一般隱球菌明顯增多，這是因為隱球菌形態變化過程中發生不伴隨細胞分裂的DNA復制(DNA replication without fission)[22,24]。由此可見，隱球菌巨大菌體的形成與隱球菌獨特的細胞周期調節方式有關，但具體機制尚待研究。

培養過巨噬細胞的培養基和缺鐵條件均可在體外誘導巨大菌體形成[24,25]。在研究新生隱球菌交配型過程中發現，隱球菌MATα菌株產生的信息素(pheromone)可使交配型MATa隱球菌菌體變大，而MATa產生的信息素可使MATα形成萌發芽管(germ tube)[26]。Okagaki等發現MATa和MATα單獨感染時均可在小鼠肺組織中形成巨型隱球菌，但兩者混合接種于小鼠肺內會使更多的MATa型隱球菌菌體變大，而發生形態學改變的MATα菌比例同前[22]。最近研究發現，巨大菌體的產生受2種G蛋白耦聯受體﹝Ste3a信息素受體(pheromone receptor)和Gpr5 受體﹞調控，這2種受體通過cAMP/PKA信號轉導途徑調節轉錄因子Rim101，導致隱球菌細胞周期和分裂方式改變，產生巨大菌體[25]。由此可見，隱球菌菌體變化是由外界環境和宿主內環境共同介導的復雜過程。

在巨型隱球菌與巨噬細胞共孵育實驗中發現，因為體積過大，巨噬細胞無法吞噬這種巨型隱球菌。鑒于巨型隱球菌多存在于免疫功能正常的小鼠體內，并與致病菌接種量成反比，且在合適條件下可產生子代細胞，有學者認為這種巨型隱球菌作為隱球菌感染階段的一個亞群(subpopulation)，是呼吸道隱球菌潛伏感染的原型[22,24]。巨型菌體可保護隱球菌不被宿主巨噬細胞吞噬，延長在宿主體內胞外潛伏時間，且自身內復制產生的多倍體可使其在合適條件下快速產生子代細胞[24]。吸入感染造模過程顯示，吸入感染1 d后即可在小鼠肺內發現巨型隱球菌，感染7 d后巨型隱球菌所占比例趨于穩定，說明巨型隱球菌可能僅在感染早期發揮作用[22]。而在不同交配型共感染實驗中，雖然肺內MATa巨型隱球菌比例增加，但對感染小鼠的生存時間無影響[22]。這些結果均提示巨型隱球菌潛伏感染存在的可能。

類似的潛伏機制也存在于肺孢子菌(Pneumocystis)和球孢子菌(Coccidioides)的致病過程中。肺孢子菌和球孢子菌可在宿主體內分別生成孢囊(cyst)和內孢囊(spherule)，抵御肺泡巨噬細胞的吞噬，并能在孢囊成熟后發生破裂，釋放其中所含的孢子從而致病[27,28]。而隱球菌巨大菌體也可抵御巨噬細胞的吞噬，且可在合適條件下快速出芽、生殖，產生子代細胞。這與前兩者的潛伏機制有異曲同工之處。

4 展望

抵抗力強、體積小的隱球菌孢子有利于通過吸入途徑進入宿主體內，而巨大菌體形成和莢膜變大分別在潛伏感染和適應環境過程中發揮重要作用。新技術的出現為人們研究隱球菌形態學變化的意義提供了可能，可直接觀察致病菌與宿主細胞相互作用的過程。目前仍需更多研究從分子和基因角度闡述這些過程，這對防治該病有重要意義。另外，還有許多問題需要人們去探索，如孢子吸入與潛伏感染之間的聯系，兩者是承前啟后的關系，還是平行進行的？同時，人類和動物并不是隱球菌的主要生態環境(ecologic niche)，隱球菌進化擁有的這種形態學變化能力可能并不是用于抵御非天然宿主的免疫反應，這提示人們尋找其他天然模式生物(如阿米巴原蟲、蠟蛾)來更好地研究隱球菌形態學變化的分子調控機制[16]。

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