大腸埃希菌外膜蛋白酶T毒力機制的研究進展

惠長野，黃勝和，曹虹，張艷芳

1. 深圳市職業病防治院，深圳 518001； 2. 南方醫科大學，廣州 510515

Omptins家族蛋白是在腸桿菌科細菌中發現的一類定位于外膜的蛋白酶，包括大腸埃希菌外膜蛋白酶T(outer membrane protease T, OmpT)和OmpP、沙門菌PgtE、鼠疫耶爾森菌Pla和福氏志賀菌SopA[1]。它們的氨基酸序列具有高度同源性(45%～80%)，并具有保守的空間構象，由反向平行的β片層包繞而形成中空的桶狀結構，錨定在菌體外膜，酶活性中心結構域伸向外膜空間，行使生物學功能[2]。Omptins具有絲氨酸蛋白酶和天冬氨酸蛋白酶特點，脂多糖對酶活性的發揮至關重要[3]。近年來越來越多的研究表明，Omptins與革蘭陰性菌毒力相關，但成員之間有較大差異[4]。

編碼大腸埃希菌OmpT的基因ompT長久以來被認為是一種管家基因。處于高濃度尿素的細胞裂解液中，OmpT仍保持水解活性，這是引起重組蛋白降解的主要原因[5]。目前，商品化的原核表達宿主菌都是ompT缺陷型。OmpT可能與大腸埃希菌毒力相關，一方面源于Omptins家族Pla及PgtE被證明是耶爾森菌和沙門菌重要的毒力因子；另一方面主要來源于大量的流行病學分析數據，如不同國家和地區學者收集到的尿路致病性大腸埃希菌(uropathogenicEscherichiacoli, UPEC)中OmpT都有很高的檢出率，認為其可能是泌尿道感染的細菌毒力因子[6-8]。有研究表明，OmpT在大腸埃希菌腦膜炎分離株中的分布高達96%，顯著高于其他典型腦膜炎致病毒力因子[9]。皮膚和軟組織感染相關的102株大腸埃希菌分離株中，80%攜帶有OmpT，而其他毒力因子檢出率最高的CNF1僅為32%[10]。

大腸埃希菌OmpT作為多功能蛋白，以多機制參與細菌感染侵襲過程。目前，對其致病機制的研究主要集中在以下幾個方面：①通過發揮蛋白酶活性，參與毒力因子前體加工；②降解宿主細胞分泌的抗菌肽，有利于細菌在體內存活；③通過激活纖溶酶原降解細胞外基質，從而促進侵襲；④OmpT本身作為細菌黏附因子介導黏附侵襲過程；⑤可能與一些毒力基因的表達調控相關。

1 尿路感染與UPEC

尿路感染是繼呼吸道感染的機體第二大易感染疾病，病原體以UPEC為主[11]。尿路感染多發于機體免疫力低下者，以及膀胱、腎遠球小管等部位生理或功能紊亂的人群[7]。健康人中尿路感染并不常見，這與人體完善的防御機制有關。無菌尿液的沖刷不斷清除少量入侵細菌，避免上行感染發生，同時天然免疫構成了機體的主要防線。尿路上皮細胞可分泌多種蛋白以抵御微生物入侵，已知的有Tamm-Horsfall、乳鐵蛋白(lactoferrin)和脂鈣蛋白(lipocalin)，這些黏蛋白覆蓋于上皮細胞表面，不利于致病菌黏附。組成型和誘導型抗菌肽，如α防御素(α-defensin)、β防御素、抗菌肽(cathelicidin)等的分泌，可直接殺傷侵入的病原菌[12,13]。尿路上皮同時存在2類分子：一類是受體分子(細胞表面結構、單純蛋白、糖蛋白等)，可識別并結合特異性的致病菌黏附相關因子；另一類是效應分子，包括抗菌肽類和一些可快速中和入侵病菌的蛋白，化學因子及細胞因子的分泌可誘導吞噬細胞向感染部位聚集，激活后吞噬能力大大提高[14]。

尿路感染好發于女性，與其尿路解剖生理有關，女性尿道短，尿道口在會陰部和肛門附近。UPEC易沿尿道上行，借助1型菌毛等黏附因子定植于膀胱。如何突破天然免疫防御并成功侵襲膀胱上皮細胞是實現感染的關鍵[15]。FimH、CNF1、SurA、OmpA等已通過細胞模型和動物模型證實與UPEC黏附侵襲毒力相關[11,16]。OmpT、KpsMT等在糞大腸菌群中也有較高分布，但在UPEC中有更高的檢出率，是否與UPEC毒力有關還有待相關研究證實[6,7,9]。

2 OmpT的底物與切割位點

OmpT是引起外源重組蛋白降解的最重要蛋白水解酶，可從已鑒定的OmpT底物來推測其在體內的生理功能[17]。表1列出已證實的OmpT底物肽或蛋白的作用位點，可看出OmpT主要識別并水解由堿性氨基酸Arg和Lys殘基組成的肽鍵，而旁側氨基酸序列特征性不強[17]。攜帶有α溶血素(α-hemolysin, HlyA)信號肽的融合蛋白，分泌過程中通過大腸埃希菌外膜時被OmpT剪切去除信號肽[18]。OmpT參與霍亂弧菌毒素蛋白前體的翻譯后加工[19]。從已有的研究報道推測，OmpT可能與某些毒力因子前體分泌過程的剪切加工有關。

表1 已鑒定的OmpT底物及識別序列Tab.1 Substrates and cleavage sites of OmpT

近年來研究表明，水解陽離子抗菌肽和抵抗宿主天然免疫防御體系可能是OmpT的主要生理功能之一[20, 21]。魚精蛋白主成分salmine AI富含連續精氨酸，ompT+株表現出對其明顯的抗性，salmine AI已作為OmpT體外活性測定的最適底物[3]。在機體正常情況下，天然免疫重要效應分子抗菌肽始終維持較低水平表達。當致病菌入侵時，抗菌肽被迅速誘導至一個高水平表達，進而發揮抗感染作用[13]。在感染初期，通常在幾分鐘至幾小時，天然免疫激活，在入侵病原菌復蘇及繁殖之前，就將其完全清除，且不引起明顯的炎癥反應[7]。相比之下，適應性免疫(高度專一的抗體、T細胞受體依賴的淋巴細胞等)在徹底消滅病原體及防止再感染方面有重要意義[13]。

防御素在病原體入侵時可迅速誘導表達，OmpT被證實與UPEC抵抗這類抗菌肽密切相關，有利于細菌在尿路中存活而引發感染[20]。對防御素這類廣泛分布于動植物界的陽離子抗菌肽序列進行分析，富含堿性氨基酸及半胱氨酸是防御素的共性。表2列舉了已鑒定的人源防御素序列，這些連續堿性氨基酸殘基形成的肽鍵作為OmpT水解滅活的位點還有待證實。但最新研究成果很好地支持了這一假說，腸出血性及腸致病性大腸埃希菌OmpT被證實與LL-37抗性有關，質譜表明OmpT正是作用于LL-37的2個假定水解位點(圖1A)[22]。底物抗菌肽二級結構和假定水解位點如圖1所示(PyMol軟件作圖)。此外，Omptins家族成員OmpP和PgtE也被證實與抗菌肽抵抗有關[23,24]。

ZF-RNase-3是來源于斑馬魚的RNA酶，同時具有殺菌活性。 進一步的研究發現，ZF-RNase-3

A: LL-37 (PDB ID: 2K6O)，LLGDFFRKSKEKIGKEFKRIVQRIKDFLRNLVPRTES；B: β-defensin-2 (PDB ID: 1E4Q)，PVTCLKSGAICHPVFCPRRYKQIGTCGLPGTKCCKKP；C: α-defensin-1 (PDB ID: 3LO4)，ACYCRIPACIAGERRYGTCIYQGRLWAFCC.

表2 已鑒定的人源防御素氨基酸序列Tab.2 Amino acid sequences of human defensins

需利用病原體蛋白酶的加工才能生成具有抗菌活性的肽段，OmpT被證實是這一環節的關鍵酶[25]。這可能是病原體與宿主協同進化的結果。OmpT不僅作用于宿主抗菌肽，還可作用于細菌素。ColE2是大腸埃希菌分泌的、具有殺菌活性的內切酶，ColE2與免疫蛋白Im2由細菌以聚合體的形式分泌，有效降低了ColE2對產生菌自身的殺滅活性，更重要的是防止OmpT對ColE2的水解滅活[26]。

3 OmpT與細菌毒力

3.1 OmpT激活纖溶酶原活性

纖溶酶在體內具有抗凝及降解細胞外基質的活性，許多致病菌都產生并利用纖溶酶原激活劑作用于凝血系統，一些致病株利用表面受體結合纖溶酶(原)并使酶激活免受生理抑制，有利于其突破正常組織屏障[27]。大腸埃希菌外膜組分被證實具有激活纖溶酶原的活性，OmpT與耶爾森菌的纖溶酶原激活劑Pla同源性達47%[28]。McCarter 等[17]利用噬菌體展示肽庫研究OmpT的底物專一性，確定OmpT識別位點上下游6個氨基酸的分布概率，其中包括天然纖溶酶原激活位點。純化的OmpT蛋白最終被證實是纖溶酶原的弱激活劑[29]。

凝血系統的激活是機體抗感染機制之一，纖維蛋白沉積可有效阻止病原體侵襲擴散，激活纖溶酶原是病原體的抵抗策略之一[27]。來源于人體的內源性抗凝劑——組織因子途徑抑制劑(tissue factor pathway inhibitor，TFPI)被證實是Omptins的理想底物，Pla、OmpT和PgtE對其水解滅活的速率甚至高于對纖溶酶原的激活[30]。這可能是人體TFPI在長期進化過程中產生對抗病原體抗凝的機制，也是嚴重感染引發敗血癥患者出現血管內彌散性凝血的原因之一。

3.2 OmpT提高細菌黏附活性

ompT敲除可導致新生兒腦膜炎大腸埃希菌分離株RS218在體外黏附腦微血管內皮細胞的能力下降20%[31]。UPEC臨床分離株CFT073缺失ompT，重要的菌毛黏附因子FimH等毒力因子表達不受影響，但體外黏附人膀胱上皮細胞及體內定植小鼠膀胱的能力顯著降低[32]。ompT敲除株回補ompT表達質粒及ompT點突變致酶活性喪失質粒，菌株黏附能力均得到恢復，提示OmpT對菌株黏附能力的影響不是通過酶活性介導的[33]。OmpT具有蛋白水解活性，不同于一般的細菌黏附因子，上皮細胞中OmpT相互作用蛋白的分離和鑒定有利于OmpT介導細菌黏附詳細機制的闡明。

菌毛黏附因子介導微生物黏附侵襲在致病性大腸埃希菌中較常見。在致新生兒腦膜炎大腸埃希菌分離株中可被唾液酸半乳糖苷識別的S型菌毛很普遍，但其在腦膜炎發病中的作用還未充分闡明[31]。Parkkinen等[34]研究表明，SfaA可捕獲纖溶酶原并促進酶原激活，降解細胞外基質，促進細菌穿越基底膜。OmpT及SfaA在纖溶酶原激活過程中是否存在協同作用，有待進一步研究。

3.3 OmpT的表達調控

ToxR是霍亂弧菌的一種跨膜DNA結合蛋白，它至少參與了17個毒力基因的表達調控。ompT是已知唯一被其下調的毒力基因。關于OmpT在致病過程中的表達調控，知之甚少。Li等研究表明，ToxR直接結合到ompT啟動子A/T富集區，在轉錄水平抑制OmpT表達，cAMP受體蛋白可激活OmpT表達[35]。在216株UPEC中，ompT與kpsMT、cnf1、sfa、prf這些毒力基因遺傳學上并非緊密連鎖，推測在功能及調控上相關[8]。不同來源的ompT+株對同種抗菌肽的抵抗能力并不相同，各分離株中ompT轉錄水平存在較大差異。相當一部分ompT+株中OmpT一般情況下并不表達[5,20]。最新研究指出，抗菌肽接觸病原體后，與抗性相關的基因表達可迅速上調[22]。針對不同感染組織內環境的差異，細菌在與宿主長期斗爭中進化了一套精密的表達調控機制。

4 結語

OmpT是一種毒力相關因子，與大腸埃希菌尿路感染相關。作為一種多功能蛋白，抵抗宿主陽離子抗菌肽、激活纖溶酶原是其重要的生理功能。此外，OmpT是否以黏附因子的身份介導細菌侵襲還有待進一步研究。隨著細菌對抗生素的耐藥日趨嚴重，人們對抗菌肽寄予厚望，而對OmpT這類蛋白酶毒力機制的深入研究有利于新型耐酶抗菌肽的設計，也為探尋新的抗感染途徑、篩選新藥作用靶點提供了可能。

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