上海口岸輸入性肺結核病患病率及其耐藥性監測

王健，葉魏，章琪，陸曄，張曉航，韓曉輝，孟成艷，周嫻，賈哲甫，方筠

上海國際旅行衛生保健中心，上海 200335

在出入境人員及移民健康評估中，傳染性肺結核病篩查與患者分類管理是全球肺結核病防控的重點工作之一，也是我國肺結核病防治工作網絡的重要組成部分。世界衛生組織(World Health Organization，WHO)的調查報告顯示，肺結核病疫情在全球范圍內明顯回升的一個主要原因是全球移民人群增多，因此呼吁主要移民輸出國及輸入國需加強出入境或移民申請者的肺結核病篩查。

傳染性肺結核病一直是我國衛生檢疫重點監測的傳染病之一。近年來，WHO報道肺結核病疫情上升及耐藥肺結核病在世界范圍內傳播。考慮到耐藥肺結核病對公共衛生可能帶來的嚴重危害，口岸衛生檢疫傳染性肺結核病將面臨新的技術和管理方式的改變。在我國，對輸入性肺結核病患病和耐藥情況監測鮮有報道。本研究對2010年1月～2011年8月上海口岸輸入性肺結核病患病和耐藥情況進行了調查，以了解上海口岸輸入性肺結核病的耐藥特征，為直接督導下的短程化療(directly observed treatment short-course，DOTS)提供用藥指導，也為口岸制定預防監管措施提供依據。

1 材料與方法

1.1 研究對象和方法

針對2010年1月～2011年8月從上海口岸入境申請來上海居留、工作、學習1年或1年以上的外籍申請者或符合我國入境人員肺結核病監測要求的人群中[1]胸部影像學呈活動性肺結核病表現者，直視下連續3 d采集空腹晨痰，濃縮集菌法處理痰液，經痰涂片抗酸染色和結核分枝桿菌復合群(Mycobacteriumtuberculosiscomplex, MTB complex)培養及鑒定后，對分離培養的MTB complex進行鏈霉素(streptomycin，STR)、異煙肼(isoniazid，INH)、利福平(rifampicin，RIF)、乙胺丁醇(ethmbutol，EMB)、吡嗪酰胺(pyrazinamide，PZA)的藥敏測定。同期采集相關人口學資料，按WHO劃分的全球6個地區進行相關數據整理。以我國第5次全國肺結核病流行病學抽樣調查數據和WHO 2011年全球肺結核病控制報告的數據為參照。

1.2 研究項目和定義

研究項目包括上海口岸輸入性活動性肺結核病的患病率、涂片陽性率(簡稱涂陽率)、培養陽性率(簡稱培陽率)及對抗結核藥物的耐藥率。相關定義如下：活動性肺結核病患病率是指胸部影像學呈活動性肺結核病表現的人員數與總篩查人數之比[2-4]；涂陽率是指痰涂片中抗酸桿菌呈陽性的活動性肺結核病患者與總篩查人數之比；培陽率是指痰液MTB complex培養陽性的活動性肺結核病患者與總篩查人數之比。對抗結核藥物總耐藥率是指對1種或1種以上抗結核藥物耐藥的致病株與分離培養出的所有致病株之比。耐多藥結核病(multidrug-resistant tuberculosis, MDR-TB)率是指同時對INH和RIF耐藥的致病株與分離培養出的所有致病株之比[3,5]。

1.3 主要儀器

主要儀器包括負壓潔凈系統(江蘇吳江綠島凈化工程有限公司)、生物安全柜(美國Becker公司)、BACTEC 960全自動分枝桿菌培養儀器(美國BD公司)、MTB complex核酸雜交檢測系統(美國Gen-Probe公司)、冷凍臺式離心機(美國Beckman公司)等。

1.4 主要試劑

MGIT960液體試劑、SIRE藥敏試劑盒、PZA藥敏試劑盒、PANTA試劑購自美國BD公司，MTB complex核酸雜交試劑購自法國生物梅里埃公司，改良羅氏培養基、丙酮酸鈉羅氏培養基、MPB64分泌蛋白金標檢測試劑購自杭州創新生物檢控技術有限公司，抗酸染色試劑購自BASO公司。

1.5 痰液處理[6,7]

取受檢人員的空腹晨痰10 ml，放入50 ml無菌離心管，采用NaOH-N-乙酰半胱氨酸(N-acetyl-L-cysteine，NALC)法對痰液進行液化除菌，4 000g4 ℃離心15 min后棄上清液，用1.5 ml無菌磷酸緩沖液(phosphate buffered saline，PBS)重懸沉淀。

1.6 痰涂片抗酸染色檢查

取上述處理后的痰懸液100 μl，制備痰涂片，干燥固定后，采用萋-納抗酸染色法進行抗酸染色，詳見試劑說明書。

1.7 痰標本分離培養MTB complex[6,7]

取處理后的痰懸液500 μl，加入含PANTA試劑的MGIT培養管，混勻后放入BACTEC 960全自動分枝桿菌培養儀液體培養。各取上述處理后的痰懸液250 μl，分別加入改良羅氏培養基和丙酮酸鈉羅氏培養基，于37 ℃孵箱中固體培養，每周觀察2次細菌生長情況。發現有細菌生長，即進行細菌抗酸染色檢測；對抗酸染色陽性細菌，繼續進行MTB complex鑒定。

1.8 MTB complex鑒定方法

液體培養快速篩查法：將抗酸染色陽性的液體生長管顛倒混勻，取100 μl混合物用凱必利金標試劑進行MPB64分泌蛋白檢測，對呈陽性的液體生長管繼續進行藥敏檢測[8,9]。固體培養基菌落鑒定法：采用Gen-Probe核酸雜交鑒定法，取抗酸染色陽性細菌進行核酸雜交，操作步驟按試劑說明書進行。相對光單位(relative light unit, RLU)≥30 000為陽性，鑒定為MTB complex，繼續進行藥敏檢測；<30 000的為陰性，鑒定為非結核分枝桿菌(non-tuberculosisMycobacterium，NTM)，不進行藥敏檢測。

1.9 藥敏檢測方法

采用MGIT液體法檢測細菌對STR、INH、RIF、EMB和PZA 5種抗結核藥物的敏感度。其檢測終濃度為STR 1.0 μg/ml、INH 0.1 μg/ml、RIF 1.0 μg/ml、EMB 5.0 μg/ml、PZA 100 μg/ml[10]。按試劑說明書進行操作。結果判斷方法：按照BD960分枝桿菌培養儀報告結果，S為敏感、R為耐藥，X為測定失敗，需重新測定。

1.10 統計方法

入境人員的人口學資料來源于上海國際旅行衛生保健信息管理系統，標本的實驗室數據來自檢測記錄。數據整理和統計表制作使用Microsoft Excel。采用SPSS16.0統計軟件進行統計處理，兩組間比較采用χ2檢驗，P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 上海口岸輸入性肺結核病篩查人口學資料

2010年1月～2011年8月共篩查肺結核病79 465人次。人口學資料顯示，762人來自非洲地區，12 111人來自美洲地區，531人來自中東地區，16 500人來自歐洲地區，4 023人來自東南亞地區，45 538人來自西太平洋地區。監測到肺結核患病者79例，其中1例來自非洲地區、2例來自美洲地區、1例來自中東地區、14例來自歐洲地區、13例來自東南亞地區、48例來自西太平洋地區。監測到傳染性肺結核患病者23例，其中3例來自歐洲地區、2例來自東南亞地區、18例來自西太平洋地區(表1)。

表1 上海口岸輸入性肺結核病患病率、涂陽率、培陽率與全球同期數據的比較Tab.1 Comparison of prevalence rates, culture-positive rates, smear-positive rates of active tuberculosis in Shanghai port and other areas (per 100 000 persons except where indicated)

2.2 上海口岸輸入性肺結核病患病率及涂陽率、培陽率監測

2010年1月～2011年8月監測入境外籍人員79 465人次，其中79人次胸部影像學呈活動性肺結核病表現，表明上海口岸輸入性肺結核病患病率為99/10萬。濃縮集菌法痰涂片抗酸染色檢查結果顯示，痰涂片抗酸桿菌陽性21例，涂陽率為26/10萬。23人次痰標本分離培養出MTB complex，培陽率為29/10萬(表1)。

與2011年WHO報道全球結核病監測數據相比：全球結核病患病率175/10萬，涂陽率為57/10萬。上海口岸輸入性肺結核病患病率低于全球結核患病率(χ2=25.648，P<0.01)。地區結核病監測數據顯示，上海口岸來自東南亞地區、西太平洋地區和歐洲地區入境人員的肺結核病監測數據與當地WHO監測數據無顯著差異；同期上海口岸未監測到來自非洲地區、美洲地區和中東地區的肺結核病患者(表1)。

與我國2010年結核病流行病學抽樣調查數據相比：我國活動性肺結核病患病率為459/10萬，涂陽率66/10萬，培陽率119/10萬[2]。上海口岸輸入性肺結核病患病率、培陽率、涂陽率均顯著低于我國相應水平(χ2=254.5，P<0.01；χ2=63.72，P<0.01；χ2=20.336，P<0.01)。

2.3 上海口岸輸入性肺結核病的耐藥性監測

對來自23例輸入性肺結核病患者的23株MTB complex菌株進行對5種抗結核藥物的耐藥性檢測。結果顯示，23株MTB complex菌株中，有9株至少對1種抗結核藥物耐藥，總耐藥率為39.1%(9/23)；2株單耐STR，耐藥率為8.7%(2/23)；1株單耐INH，耐藥率為4.3%(1/23)；5株單耐PZA，耐藥率為21.7%(5/23)；1株耐3種藥物(INH、EMB、PZA)，耐藥率為4.3%(1/23)；未檢測到MDR耐藥株(表2)。

表2 上海口岸輸入性肺結核病耐藥情況與我國肺結核病耐藥監測數據的比較Tab.2 Drug resistance rates of active tuberculosis in Shanghai port and other areas

與我國2010年肺結核病耐藥監測數據相比：上海口岸輸入性肺結核病總耐藥率為39.1%，接近我國2010年肺結核病總耐藥率36.8%(χ2=0.05，P=0.823)。單耐藥率監測數據比較結果顯示，上海口岸輸入性肺結核病對INH、RIF、STR、EMB的單耐藥率與我國2010年肺結核病耐藥監測數據無顯著差異(表2)。

與上海地區2007年肺結核病耐藥監測數據相比：上海口岸輸入性肺結核病總耐藥率為39.1%，高于上海地區2007年的17.9%(χ2=6.703，P=0.01)[11]。單耐藥率監測數據比較結果顯示，上海口岸輸入性肺結核病對INH、RIF、STR、EMB的單耐藥率與上海2007年肺結核病耐藥監測數據無顯著差異。

與全球其他地區肺結核病耐藥監測數據相比：上海口岸輸入性肺結核病總耐藥率為39.1%，高于我國香港地區的14.4%(χ2=11.285，P=0.001)，也高于國際中位數水平12.1%(χ2=14.047，P<0.001)。單耐藥率監測數據比較結果顯示，上海口岸輸入性肺結核病對INH、RIF、STR、EMB的單耐藥率與我國香港地區和國際肺結核病耐藥監測數據無顯著差異[12-16]。

3 討論

2010年1月～2011年8月上海口岸入境居住1年及1年以上外籍申請人員79 465人次，其中影像學診斷活動性肺結核病79人次。活動性肺結核病患病率為99/10萬，低于我國15歲以上人群和同期WHO報道的全球結核病患病率水平。采集上述79例患者的痰液進行MTB complex實驗室檢測，培陽率29/10萬，顯著低于我國15歲以上人群活動性肺結核病的培陽率119/10萬；而培陽百分比為29%(23/79)與我國報道水平接近。痰涂片抗酸桿菌檢測結果顯示，上海口岸活動性肺結核病患者涂陽率26/10萬，顯著低于我國活動性肺結核患者的涂陽率66/10萬；涂陽百分比為27%(21/79)，高于我國報道的14.4%，但低于WHO 2011年報道的57%。上述數據說明，上海口岸輸入性肺結核病患病率較低，培陽率也顯著低于國內水平，但培陽百分比與國內報道水平相當。

WHO 2011年報道全球耐藥肺結核病達創紀錄水平，隨之而來的公共衛生危害風險明顯升高。我國進行出入境人員的耐藥肺結核病監管是衛生檢疫的新任務。本研究耐藥監測結果顯示，上海口岸結核病對一線抗結核藥物的總耐藥率為39.1%，接近我國總耐藥水平，但高于上海本地水平，也顯著高于我國香港地區和國際(中位數)耐藥水平。我國2010年第5次肺結核病流行病學調查報道全國的肺結核病耐藥率為36.8%。WHO 2011年全球耐藥監測報告顯示，我國是全球耐藥肺結核病最嚴重的地區之一，因此上海口岸輸入性肺結核病的耐藥問題不容忽視。

上海口岸肺結核病對單種藥物耐藥水平的監測結果顯示，5種一線抗結核藥物中，對PZA耐藥率高達21.7%，對STR耐藥率其次，為8.7%，對RIF耐藥率最低。上海口岸肺結核病單INH、STR、EMB、RIF耐藥率均接近國內外報道水平。從調查數據來看，各地區肺結核病對RIF的耐藥率均低于其他一線抗結核藥物，提示在對我國口岸傳染性肺結核病患者進行DOTS治療時，要重視藥物配伍，提高治療效率。

MDR-TB是WHO耐藥監測體系中十分重要的指標，反映了肺結核病的嚴重程度。本研究沒有在上海口岸監測到輸入性MDR-TB患者。僅發現1例INH、EMB、PZA合并耐藥結核病，而上海本地這種類型的耐藥率為0.1%[17]。由此說明上海口岸傳染性肺結核病的耐藥情況很復雜。

本次調查對上海口岸輸入性耐藥肺結核病的情況有了初步了解，認識到上海口岸不但面臨耐藥性結核病傳入的風險，而且耐藥情況復雜。傳染性肺結核病始終是我國口岸衛生監管的主要傳染病，但受檢測技術的限制，目前采用培養法檢出MDR-TB通常要4周，而廣泛耐藥結核病的檢出需要更長時間，這段時間內耐藥肺結核病基本處于無監管狀態。本研究數據提示，上海口岸輸入性肺結核病的耐藥率處于較高水平。考慮到耐藥肺結核病對公共衛生的巨大危害，衛生監管部門應重視這段時期對患者的宣教、隔離和治療,同時也需修訂相關政策。

本研究還發現，上海口岸輸入性肺結核病對PZA耐藥率達26.1%(6/23)，其中單耐PZA達21.7%，明顯高于對另外4種藥物的耐藥率，也高于國內報道的對單種藥物的耐藥率。國內目前較少開展對PZA的耐藥性檢測，也未見相關數據報道，無法了解國內對PZA耐藥結核病的流行狀況。對PZA的高耐藥率是造成上海口岸輸入性肺結核病總耐藥率高的一個重要原因，其流行病學特征和分子基礎還不清楚，這是今后研究的方向[18,19]。PZA是一線抗結核治療藥物，輸入性肺結核病患者對PZA的高耐藥率現狀直接為治療藥物的選擇提供了參考依據。

本研究79例輸入性結核患者中，MTB complex培陽百分比僅為29%。如何提高口岸入境人群MTB complex培陽率，以及如何監管痰培養陰性的肺結核病入境人員是上海口岸傳染性肺結核病監管面臨的巨大挑戰，也是進行輸入性耐藥肺結核病監測的前提。

目前，國際旅行人員的傳染性肺結核病監管還沒有納入WHO/國際防癆和肺部疾病聯合會(International Union Against Tuberculosis and Lung Disease，IUATLD)全球抗結核藥物耐藥監測網絡，各國的監管策略差別很大。隨著經濟全球化的發展，我國正面臨越來越多的輸入性耐藥肺結核病患者，因此有必要建立具口岸特征的傳染性肺結核病監管模式，監測口岸耐藥水平的發展趨勢，管理好輸入性耐藥肺結核病患者。這不僅是國家公共衛生安全的重大事件，也完全符合WHO“阻止肺結核病傳播”全球計劃的精神。

[1] 國家質量監督檢驗檢疫總局.出入境人員肺結核病監測要求[S].北京，國質檢衛[2002]第113號.

[2] 衛生部疾病預防控制局中國疾病預防控制中心.全國第五次結核病流行病學抽樣調查資料匯編[G]. 北京：軍事醫學科學出版社，2011，12.

[3] 全國肺結核病流行病學抽樣調查技術指導組.第四次全國肺結核病流行病學抽樣調查報告[J].中華結核和呼吸雜志, 2002，25(1)：3-7.

[4] Tuberculosis Prevalence Surveys: a Handbook. WHO 2011 [EB/OL]. http://www.who.int/tb/advisory_bodies/impact_measurement_taskforce/resources_documents/thelimebook//en/index.html.

[5] WHO. Global tuberculosis control 2011 [EB/OL]. http://www.who.int/tb/publications/global_report/en/.

[6] 中國防癆協會基礎專業委員會.肺結核病診斷細菌學檢驗操作規程[S].北京：中國防癆協會，1995,10.

[7] 中華人民共和國衛生部. WS288-2008傳染性肺結核診斷標準[S/OL]. http://www.moh.gov.cn-sofpro-cms-previewjspfile-zwgkzt-cms_wsbz_list_tpl.jsprequestCode=2743&tag1209157245734PageNo=25.

[8] Yu MC, Chen HY, Wu MH, Huang WL, Kuo YM, Yu FL, Jou R. Evaluation of the rapid MGIT TBc identification test for culture confirmation of Mycobacterium tuberculosis complex strain detection [J]. J Clin Microbiol, 2011, 49(3): 802-807.

[9] Moore DA, Evans CA, Gilman RH, Caviedes L, Coronel J, Vivar A, Sanchez E, Piedo Y, Saravia JC, Salazar C, Oberhelman R, Hollm-Delgado MG, LaChira D, Escombe AR, Friedland JS. Microscopic-observation drug-susceptibility assay for the diagnosis of TB [J]. N Engl J Med, 2006, 355(15):1539-1550.

[10] World Health Organization. Policy guidance on drug-susceptibility testing (DST) of second-line antituberculosis drugs [EB/OL]. http://www.who.int/tb/publications/2008/whohtmtb_2008_392/en/index.html.

[11] 梅建，沈鑫，沈梅，桂曉虹, 孫斌.上海市結核分枝桿菌復合群耐藥性監測研究報告[J]. 中國防癆雜志，2007，29(5)：395-398.

[12] 王國斌.河南省肺結核病耐藥情況調查及分析[J].臨床肺科雜志，2003，8(4)：350-352.

[13] 鐘球，錢明，李建偉，陳啟亮,卓文基,江勇,黃樹智,陳燕梅.廣東省WHO肺結核病耐藥監測研究[J].中國防癆雜志，2001，23(1)：5-8.

[14] 李群，王曉萌，何海波，鐵牛,韓永興,孫頌文,姚強,朱一凡,徐旭卿. WHO浙江省肺結核病耐藥監測研究報告[J].中華結核和呼吸雜志，2000，23(12)：718-721.

[15] 王甦民，張福生，端木宏謹.山東省耐藥肺結核病流行狀況研究[J].中華結核和呼吸雜志，1999，22(12)：728-731.

[16] 李國明，吳興榮，張緹，周麗平,李克國,劉勛,李愛國,戴憲法,袁方玉.湖北省結核分枝桿菌復合群耐藥性監測研究[J]. 中華結核和呼吸雜志，2002，25(12)：723-726.

[17] 劉一典,唐神結,張青, 景玲杰，韓敏，樂軍.上海本地結核分枝桿菌復合群分離株一線和二線抗結核藥物的耐藥性分析[J].中華傳染病雜志,2011,29(9):544-548.

[18] Jonmalung J, Prammananan T, Leechawengwongs M, Chaiprasert A. Surveillance of pyrazinamide susceptibility among multidrug-resistant Mycobacterium tuberculosis isolates from Siriraj Hospital, Thailand [J]. BMC Microbiol, 2010, 10: 223.

[19] Muthaiah M, Jagadeesan S, Ayalusamy N, Sreenivasan M, Prabhu SS, Muthuraj U, Senthilkumar K, Veerappan S. Molecular epidemiological study of pyrazinamide-resistance in clinical isolates of Mycobacterium tuberculosis from South India [J]. Int J Mol Sci, 2010,11(7): 2670-2680.