廣西傳統發酵米粉中乳酸菌的分離鑒定

史國英，余功明，胡春錦*

(1.廣西農業科學院微生物研究所，廣西南寧530007;2.廣西作物遺傳改良生物技術重點開放實驗室，廣西南寧530007;3.廣西大學農學院，廣西南寧530005)

在眾多的大米加工食品中，米粉作為一種傳統主食具有獨特的優勢，在我國南方及東南亞地區有廣闊的市場。據相關資料報道，廣西的米粉生產和消費量巨大，目前共有米粉生產廠三百多家，制售米粉的飲食店、米粉零售代銷點五千多家，每天銷售米粉約400萬kg［1］。發酵米粉是我國南方傳統米粉的一種特殊生產方法，即將大米于自然條件發酵后再以常規榨粉方法生產米粉。經過自然發酵生產的發酵米粉，口感爽滑，有筋道感，品質優于不發酵米粉，深受消費者的喜愛。但是，由于我國目前對本土的傳統食品開發不夠，米粉加工技術普遍比較落后，發酵米粉的生產基本上是手工作坊式的，生產規模小，對傳統工藝的實質不清楚，產品質量不穩定［2］。因此，對發酵米粉進行產業化、規范化的生產是產業發展的必然趨勢。而要達到這一目標必需對米粉自然發酵過程的相關機制有深入的了解，其中弄清楚在發酵過程中起作用的微生物以及這些微生物的特性是基礎和前提。廣西作為米粉生產和消費量巨大的省區，對傳統發酵米粉發酵過程中相關微生物的研究卻鮮有報道。據報道［3］，米粉發酵以厭氧發酵為主，乳酸菌是發酵過程中的主要優勢菌群。本文對廣西傳統發酵米粉發酵過程中的乳酸菌進行分離鑒定，擬為弄清廣西傳統發酵米粉中有益微生物資源及其利用提供理論依據和技術支持。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品乳酸菌分離樣品于2010年11月采自南寧市郊手工作坊式發酵米粉廠，用無菌玻璃杯從米粉發酵池中取發酵不同時間的發酵液500 mL，利用選擇性培養基分離乳酸菌。

1.1.2 培養基MRS培養基:蛋白胨10 g，牛肉膏10 g，酵母浸粉5 g，檸檬酸氫二銨2 g，葡萄糖20 g，土溫-80 1 mL，乙酸鈉5 g，磷酸氫二鉀2 g，硫酸鎂0.58 g，硫酸錳0.25 g，瓊脂10 g，水1 L，pH 6.5;LB固體培養基:蛋白胨10 g，酵母浸粉5 g，NaCl 10 g，瓊脂粉10 g，水1 L，pH 6.5。

1.2 方法

1.2.1 乳酸菌的分離①稀釋液的制備:量取米粉發酵液5 mL移入帶玻璃珠的45 mL無菌水中，以漩渦振蕩器充分振蕩3 min后，吸取1 mL注入9 mL無菌水。重復以上操作，依次用無菌水10倍系列稀釋至10-6，取10-4～10-6樣品稀釋液用于微生物分離培養;②平板接種與分離培養:取20 μL適宜稀釋度的稀釋液涂布于含碳酸鈣(3 g/L)的MRS瓊脂培養基，每個稀釋度做4個重復。分別于30和37℃培養48 h，觀察優勢乳酸桿菌典型的菌落特征。挑取CaCO3溶解圈較大的單菌落接種于MRS液體培養基中，以平板劃線法轉接5次后獲得純培養菌株，以試管斜面培養于4℃冰箱保藏。

1.2.2 菌株的常規鑒定參考《常見細菌系統鑒定手冊》［4］，通過培養性狀、革蘭染色、菌體形態觀察、過氧化氫酶試驗等對分離獲得的乳酸菌進行初步鑒定。

1.2.3 菌株的分子鑒定①細菌基因組DNA的制備:菌株活化以后以LB培養基培養1 d，收集菌體用于DNA提取。利用細菌基因組DNA提取試劑盒(上海生工生物工程技術服務有限公司提供)，按產品說明書提取各菌株的基因組DNA，保存于-20℃備用;②16S rDNA片段擴增及測序:細菌16S通用引物Primer 1(F27):(5'-AGAGTTTGATCATGGCTCAG-3')和Primer2(R1492)(5'-TACGGTTACCTTGTTACGACTT-3')由上海生工生物工程技術服務有限公司合成。PCR反應體系總體積50 μL，分別為DNA模板2.5 μL，引物(10 μmol/L)各1.5 μL，dNTP mixture 25.0 μL，ddH2O 19.5 μL。反應程序:94℃3 min預變性，然后進行94℃1 min，52℃1 min，72℃1.3 min，32個循環，最后72℃10 min。PCR擴增產物進行1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測。PCR產物純化后送上海生工生物工程技術服務有限公司測序;③菌株同源性比對:菌株的16S rDNA測序結果在GenBank上登錄，進行同源性序列搜索，利用http://blast.ncbi.nlm.nih.gov的BLAST程序進行同源性比較，并用軟件MEGA version 4.0［5］構建系統發育樹，進一步確定其分類地位。

2 結果與分析

2.1 菌株分離結果

MRS培養基中加入CaCO3，有利于顯示乳酸菌產生的高酸，乳酸可將培養基中的CaCO3溶解，在菌落周圍產生典型的透明圈，通過形成的透明圈識別乳酸菌。本研究從米粉發酵液中分離篩選獲得可產生透明圈的乳酸菌，通過多次純化得到6株純培養菌株，菌株編號依次為S1～S6。

2.2 菌株鑒定結果

2.2.1 形態學特征菌株在LB固體培養基上37℃培養2 d，S3、S4菌落大小2～3 mm，表面粗糙如雪花狀，邊緣不規則，無光澤，扁平，灰白色，在10×100倍顯微觀察下其形態為多樣，粗長桿、細長桿、彎曲桿、短桿和棒狀桿等，菌體呈長短不一的鏈桿狀排列，無芽胞，為革蘭陽性，過氧化氫酶陰性;S1、S2、S5、S6菌落大小1～2 mm，表面光滑，邊緣整齊，呈圓形，無光澤，凸起，灰白色，半透明，在10×100倍顯微觀察下其形態大小均一，呈球形或卵圓形，一般成對或鏈狀排列，無芽胞，為革蘭陽性，過氧化氫酶陰性。

2.2.2 16SrDNA基因分析利用引物F27、R1492對6株乳酸菌進行PCR擴增得到16S rDNA基因序列，擴增結果為大小約1 500 bp的單一片段。擴增片段的測序結果在GenBank上登錄，并在核酸序列數據庫中進行同源性序列搜索，結果見表1。結果表明本研究獲得的4株乳酸菌與Pediococcus pentosaceus具有較高的同源性，2株乳酸菌與Lactobacillus plantarum的親緣關系最近，可以判斷為同種。

選取典型菌株S1和S4分別構建2種乳酸菌系統發育樹。用軟件MEGA version 4.0將菌株S1與來自GenBank的17株細菌一起構建基于16S rDNA序列的系統發育樹。該系統發育樹顯示，菌株S1與戊糖片球菌Pediococcu sp.在100%bootstrap水平上相聚一群(圖1)，而與戊糖片球菌Pediococcus pentosaceus的親緣關系最近，表明該菌株S1與戊糖片球菌具有最高的遺傳相似性。S4菌株則與植物乳桿菌Lactobacillus plantarum的親緣關系最近(圖2)。

表1 6株乳酸菌的16SrDNA序列分析結果Table 1 16SrDNA sequences analysis of the six Lacti Acid Bacteria strains'

3 討論

微生物的分子生物學鑒定方法解決了傳統方法難以確定的許多菌種的分類問題，具有操作簡便、結果客觀、重復性好的優點［6］。雖然經典分類學研究實驗條件的要求不高，但方法復雜，試驗工作量大，而且結果也可能不夠精確［7］。本文結合傳統分類學和分子生物學的方法對發酵米粉中的主要乳酸菌進行分類鑒定，綜合分析所得出的鑒定結果是可靠的。

由于多數乳酸菌對人體健康的有益特性及其在國民經濟中的重要作用，近年來，利用乳酸菌發酵食品、藥品、飼料等層出不窮［8］。乳酸菌是發酵米粉中起主要作用的優勢菌群，其種類和數量對米粉發酵的時間和品種有較大的影響，自然發酵使米粉的口感得到一定程度的改善，具體表現為米粉彈性和筋道感增加［3］。本研究首次對廣西傳統發酵米粉的乳酸菌進行了分離鑒定，獲得的菌株主要為Pediococcus pentosaceus和Lactobacillus plantarum 2種乳酸菌，其中P.pentosaceus為主要優勢菌株，和魯戰會等［9］報道的湖南常德發酵米粉中乳酸菌的優勢菌株主要為L.plantarum有一定差異;本研究從南寧當地米粉樣品中分離獲得的乳酸菌均為對人體有益的菌株，未發現有潛在致病性的菌株。可見，我國傳統發酵米粉中存在著優良的自然乳酸菌菌株，而不同地區的起主要發酵作用的菌株存在一定差異，因此，在利用人工模擬自然發酵生產發酵米粉的規模化生產中，應首先考慮發掘和利用當地發酵米粉中優勢乳酸菌資源。

米粉生產基本上對大米進行了徹底利用，原料用量大，利用率高，不會造成資源浪費;傳統發酵米粉由于其獨特的風味，深得廣大消費者的喜愛，近年來米粉還逐步實現了向我國北方市場的擴展，具有廣闊的前景［10］。傳統優勢食品的整理開發是一個綜合性的研究課題，自然發酵也是一個復雜性的過程，獲得發酵過程中的優勢菌群只是一個起步，深入研究其代謝機制并明確其最佳發酵條件以及微生物發酵與米粉的特殊口感的相關性還有待進一步的研究。

［1］ 楊玉英，洪群聯，薄鎧奇.我國食品公共安全保障體系的情況與建議—廣西食品安全保障體系的調查與思考［J］.經濟研究參考，2011，(45):13-21.

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［5］ Tamura K，Dudley J，Nei M，et al.MEGA4:Molecular Evolutionary Genetics Analysis(MEGA)software version 4.0［J］.Molecular Biology and Evolution，2007，24(8):1596-1599.

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［7］ 褚學英，惠豐立，李曉輝.大曲中主要酵母菌的分子鑒定［J］.中國釀造，2008，(5):27-29.

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