石油降解菌株的分離鑒定及降油特性

雒曉芳，楊琴，陳麗華，3，周立輝，徐紅偉

(1.西北民族大學實驗中心，甘肅蘭州730124;2.長慶油田公司油氣工藝研究院，陜西西安710018;3.蘭州大學西部環境與氣候變化研究院，甘肅蘭州730000)

土壤中微生物資源豐富，自然條件下大多數微生物代謝不活躍。當這些微生物遇到適當的刺激(氧、營養等)時復蘇開始其代謝(降解)過程。對微生物進行篩選和分離可以選出降解能力較強的微生物即優勢菌，在土壤中添加這些優勢菌，可以在一定程度上提高微生物對污染物的降解作用。在長期被石油污染的土壤和活性污泥中微生物可逐步改變自身的代謝條件以適應環境條件，即以石油烴為碳源進行生長繁殖，同時將石油烴降解，因此在這種土壤中存在著可降解石油烴的微生物，石油烴降解菌的分離是生物法處理石油污染的關鍵。在自然界凈化石油烴類污染的綜合因素中微生物降解起著重要的作用，目前已報道有多個種屬具有分解和轉化石油組分的能力［1］。近年來，石油烴的生物降解受到了人們越來越多的關注，在石油污染的生物處理中，石油降解菌利用碳源而將其降解［2-4］。石油降解微生物的資源研究已經成為一個重要方向，國際上已建成專門的降解微生物菌種資源庫［5］。目前已分離鑒定的烷烴降解菌有假單胞菌(Pseudomonas)［6］、腸桿菌(Enterobacter)、不動桿菌(Acinetobacter)、棒桿菌(Nocardia)和諾卡氏菌(Corynebacterium)等［7］。由于石油污染物具有組成復雜性、生物難降解性和較低的生物可利用度等特點，土著微生物難以有效、快速、徹底地降解土壤中的石油烴［8］。同時，石油的主要成分是烷烴類物質，水溶性較低，較難被微生物利用，因此對烷烴降解菌的篩選分離是生物法處理石油污染物的關鍵。在長期被石油污染的土壤中，微生物可逐步改變自身的條件適應環境，進行選擇性富集并發生遺傳變異，因此在這種土壤中存在著可降解烷烴的微生物［9］。然而，污染土壤的石油組分復雜，大致分為烷烴(占65%～70%)、芳香烴(占10%～15%)和樹脂與瀝青質(占8%～10%)3大類，各組分的生物可降解程度不同，降解過程復雜，其中芳香烴類最難被降解。單一的細菌或真菌因產生酶的種類比較少且濃度較低，所以一般只能降解少數特定烴類或只降解到某一階段，復雜烴類的徹底降解往往需要多種微生物協同聯合作用［10］。所以，篩選高效降解石油的微生物菌種是生物修復的必然，目前有關石油降解菌方面的研究報道較多［11-12］，但尚未見到白色類諾卡氏菌(Nocardioides albus)降解石油方面的研究。因此，本課題組從甘肅華慶油田油井附近地表深度10 cm左右石油污染土壤中采樣，通過多次富集并篩選分離出1株高效石油降解菌株，利用生理生化測試和16S rDNA序列分析進行分子鑒定，初步探討了其降解特性，以期為微生物在石油污染土壤治理中的應用提供菌種資源和理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗土樣石油污染土樣取自甘肅華慶油田油井附近地表深度為10 cm左右石油污染土壤，裝入無菌袋中密閉保存于4℃冰箱。

1.1.2 培養基無機鹽培養基:NH4NO32 g/L，K2HPO41.5 g/L，KH2PO43 g/L，微量元素液2 mL，蒸餾水1 000 mL;微量元素液(g/L):MgSO4·7H2O 0.1，FeSO4·7H2O 0.2，CuSO40.1，無水CaCl20.01，Na2EDTA·2H2O 0.01;降油培養基:無機鹽培養基1 000 mL，原油6 g，若配制固體培養基需另加瓊脂20 g。保存培養基為牛肉膏5 g，蛋白胨10 g，氯化鈉5 g，瓊脂20 g，蒸餾水1 000 mL，pH 7.2～7.4。

1.2 方法

1.2.1 F1菌株的分離土樣2.5 g，添加到裝有200 mL無機鹽培養基的三角瓶中，在30℃，120 r/min的恒溫搖床上進行振蕩培養7 d，移取一定量的富集培養液接入新鮮降油培養基中，在相同條件下培養7 d，共重復3次，經過3個周期的馴化后，在無菌的條件下，用接種環蘸取馴化培養液，在降油培養基的平板上劃線后，平板倒置于恒溫培養箱中培養24～72 h，然后將代表性較好的菌落在降油培養基平板上反復劃線純化得到單一菌落，再將純化的菌株接種至斜面保存培養基上培養后，保存于4℃冰箱中，待用。

1.2.2 菌株的鑒定①生理生化鑒定:參照《常見細菌系統鑒定手冊》［13］，對菌株進行明膠液化、牛奶凝固與胨化、淀粉水解、纖維素分解、硝酸鹽還原反應、硫化氫的產生、碳源的利用、黑色素的產生等生理生化指標的檢測觀察。按文獻［14］方法進行碳、氮源利用試驗;②分子鑒定:采用細菌16S rRNA PCR通用引物，2個PCR引物分別為8F(5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3')和1512R(5'-ACGGCTACCTTGTCGACTT-3')，對應于大腸埃希菌16S rRNA基因的第8～27個堿基和第1 512～1 495個堿基。引物由寶生物工程(大連)有限公司(TaKaRa)合成。以細菌總DNA為模板，PCR反應條件:94℃5 min，1 cycle;94℃1 min、55℃1 min、72℃1.5 min，30 cycles;72℃5 min 1 cycle。把16S rDNA PCR產物與PMD18-T載體連接后轉化入大腸埃希菌感受態細胞，挑取陽性克隆，培養12 h后進行測序。將16S rDNA測序結果用Blast軟件與GenBank中15株參考菌株的16S rDNA序列進行比較分析。用分子進化遺傳學分析與序列比對軟件MEGA5.1的鄰近相接法(Neighbor-JoiningMethod)對clustalx多重比對結果進行系統進化分析，采用Boot strap方法對500個重復進行可靠性檢驗［15］，確定F1菌株的分類地位。

1.2.3 紫外分光光度法測定石油烴含量配置含油量分別為0、0.2、0.4、0.8、2.0、4.0、5.0 mg/mL的標準油樣，以石油醚(脫芳烴)為對照，在紫外分光光度計224 nm處測出不同濃度樣品的吸光度，得原油的標準曲線。土樣取自甘肅華慶油田油井污染土壤，經碎散、除雜、過篩(1.25 mm)、混均后將土壤樣品分別裝入6個體積為22 cm×6 cm×22 cm的玻璃缸。采用三級擴大培養法制備F1菌液，將其濃度達到1×1010cfu/mL后放置4℃冰箱備用。每缸裝土1 kg，每一缸為1組，分為3組。1#:1 kg污染土壤，加1 mL F1菌液，并添加3 g標準油樣，攪勻;2#:1 kg污染土壤，加1 mL F1菌液，并添加5 g標準油樣，攪勻;3#:1 kg污染土壤，加1 mL F1菌液，并添加10 g標準油樣，攪勻?？紤]到微生物有一定的存活時間，故擬定本實驗歷時42 d，加無菌水保持土壤含水率每天在20%左右，在第0、3、7、10、17、24、31、38、42天時采用5點法分別從3個缸中取土樣20 g，放入3個索氏提取器中，用150 mL沸程為60～90℃的石油醚索氏提取12 h，回流溫度為60～65℃，虹吸速度為3～5次/分，回流72 h后測得索氏提取率為90.55%，將提取液移入250 mL的容量瓶中，用紫外可見分光光度計測定3個缸中污染物含量在224 nm下的吸光度，根據原油標準曲線求得石油烴污染物的含量。

1.2.4 GS-MC測定原油各組分將F1菌株接入20 mL含10 mg原油的無機鹽培養基的三角燒瓶，28℃搖床震蕩培養7 d，取出加入氯仿10 mL，放入超聲波儀器中破乳15 min，倒入滴液漏斗中萃取出氯仿相，如此反復3次，將萃取液收集一起，放入水浴中將氯仿蒸發殆盡，剩下的殘油準確稱量后定容10 mL，即為GS-MC測試降解油樣。同樣方法，同時不添加F1菌劑設置對照組。降解油樣各組分分析條件:氣化溫度260;載氣He;柱溫200;柱SE-30(50 m);質譜條件:電子能量70 eV，質量范圍40～450。

2 結果與分析

2.1 不同濃度的原油對F1菌株的降油影響

測得原油的標準方程為y=0.019 6x①，相關系數R2為0.999 3(圖1)。為方便計算，將其轉變為250 mL樣品中所含的石油類總量和吸光度之間的關系式:M=12.755 1D②。其中，D為用250 mL石油醚萃取含油油樣得到萃取液的有效吸光度，無量綱;M為樣品所含污染物總量。

對1#、2#、3#土樣的殘留量進行回歸方程的分析，可以看出石油殘留量曲線符合一級反應動力學方程［16］:lnρ(油)=lnρ(油)-kt(1)，式中:ρ(油)可為任意時刻石油殘留量。ρ(油)為第0天殘留量，k為降解速度常數，t為半衰期。利用k值可以指示不同濃度的微生物降解速度。由(1)式可得西-27原油的半衰期公式:t1/2=ln2/k(2)。由(2)式可以計算出F1菌株在含油濃度0.3%、0.5%、1.0%土樣中降解原油的半衰期分別為17.2、18.2、23.7 d。

圖1 原油的標準曲線Fig.1 Standard curve of crude oil

由圖2可知，原油濃度為0.3%、0.5%、1.0%3組土樣的降解速度依次降低。用紫外分光光度計測得索氏提取液250 mL的Abs，根據M=12.755 1D計算得1 kg土樣在不同天數污染物殘留量，然后換算為降解率。1#、2#、3#土樣17 d降解率分別為40.23%、46.41%、42.07%，24 d達到72.02%、69.87%、56.57%，降解率均超過50%，42 d后均達到78%以上。

圖21 #、2#、3#土樣的石油烴隨時間的變化規律Fig.2 Curve of remaining TPH concentration in soil under different soil samples conditions

2.2 菌株的鑒定

2.2.1 生理生化測試F1菌株革蘭陽性;不抗酸;明膠液化;牛奶不凝固，但胨化;淀粉水解;纖維素上不生長;硝酸鹽不還原;利用D-葡萄糖、L-阿拉伯糖、D-木糖、L-鼠李糖、D-果糖、D-甘露醇;利用蔗糖，很少利用棉子糖;不利用肌醇;不產生類黑色素;產生H2S氣體。

2.2.2 分子鑒定將F1菌株16S rDNA全序列輸入GenBank核酸序列數據庫進行比對，發現與白色類諾卡氏菌(Nocardioides albus)之間的同源性達99.0%。選取近緣的菌株序列通過MEGA5.1的鄰近相接法構建系統進化樹(圖3)，將其初步確定為白色類諾卡氏菌(Nocardioides albus)。

圖3 F1菌株的系統發育樹Fig.3 Phylogenetic tree of the strain F1

2.3 F1菌株對原油不同組分的降解

所采原油為長慶油田延長組-三疊紀-湖相成油，從原油GC-MS圖譜分析可知，該地區原油正構烷烴的碳數主峰靠前為nC15，高碳數正構烷烴降解明顯，奇數碳優勢已不夠明顯，霍烷和甾烷的異構化現象明顯，均說明成烴環境微生物發育，原油演化程度高，成熟度高。非烴和多環芳烴在成烴環境中熱、壓力能量和微生物作用下，已多數演化為類異戊二烯烷烴等烴類物質，在離子流圖中較難提取，含量很少。這種特征與黃廷林等［17］研究陜北油田(同一組系)原油組分特征測定結果一致。故以氯仿提取F1降解后原油做GC-MS分析，其組分亦主要包括飽和烴(正構烷烴、霍烷、甾烷系列)，芳烴、非烴含量很少。以下對降解前后，主成分正構烷烴、霍烷系列的各個物質結構鑒定、含量及降解率分析見表1、2。2系列總離子流圖見圖4、5。

表1 7d后油樣中正構烷烴組分及降解率分析Table 1 The n-alkanes components and degradation rate of oil samples

表2 7d后油樣中霍烷主組分及降解率分析Table 2 The hopane components and degradation rate of oil samples

圖4 降解前后正構烷烴總離子流圖Fig.4 Degradation of n-alkanes before and after total ion chromatorgraphy

圖5 降解前后霍烷總離子流圖Fig.5 Degradation of hopanes before and after the total ion chromatorgraphy

由表1、2可見，等量原油經F1降解前、后，正構烷烴最大峰度從15×104下降至9×104，整體降低約40%，而且以C22為界，表現出明顯的后峰前移峰形，完全符合多數石油降解菌以原油為碳源的降解演化規律，即先降解高碳數正構烷烴為低碳數正構烷烴，在整體峰度下降中還表現出另一特征:高碳數正構烷烴中奇數碳向偶數碳正構烷烴演化規律。從表1數據可見，F1菌可以廣泛利用從C14～C39正構烷烴為碳源，降解率在42.8%～89%，平均64%，另外，雖然原油已經歷過成烴環境微生物和熱作用，奇數優勢已不如成熟度低的原油，但仍可從表1看出奇數碳正構烷烴降解率普遍高于偶數碳，表現出多數降解菌在利用長鏈飽和烴時優先降解奇數碳正構烷烴的特征。

原始原油和經歷細菌作用7 d的原油的藿烷系列碳數分布相同均為C27～C35(C28缺失)，主峰相同均為C30-αβ藿烷?；敉樽畲蠓宥葟?×104降至6.5×104，降低8%，有明顯高等植物母質輸入，與生烴古環境一致。含量最高的17α(H)，21β(H)-藿烷降解率僅是0.84%，其次是17α(H)，21β(H)-30-降藿烷，降解率16.75%，平均降解10.23%。表明原油經F1作用7 d后，烷烴受到較明顯的降解，五環三萜烷(藿烷)則比較穩定。如表2所見，Ts為18α(H)-22、29、30-三降藿烷，Tm為17α(H)-22、29、30-三降藿烷，Ts/Tm是石油地質領域常用的有機質演化程度參數。Ts/Tm比值越大反映出有機質受外作用力的程度越強，研究樣品主要改變的外作用力是F1菌作用，所以Ts/Tm比值越大則F1菌對原油的降解越強烈。雖然原油成熟度已較高，Ts含量達到3.512%，但經F1作用，仍可以看到降解后的Tm向Ts轉化，Tm降解率8.22%，Ts降解率-4.85%，表明F1菌株能較好地促使五環三萜類化合物立體構型中不穩定構型向穩定性構型轉化。

3 討論

F1菌株的形態特征和生理生化試驗指標等實驗結果與白色類諾卡氏菌(Nocardioides albus)屬的基本特征一致，同時，16S rDNA序列及同源性與Nocardioides albus的16S rDNA序列有99.0%同源性，并且在系統進化樹上表明它和Nocardioides albus屬的菌具有較近的遺傳距離。因此，將其初步確定為白色類諾卡氏菌(Nocardioides albus)。

F1菌株在含油濃度0.3%、0.5%、1.0%土樣中降解原油的半衰期分別為17.2、18.2、23.7 d，42 d后均達到78%以上。

等量原油經F1降解前后，表現出先降解高碳數正構烷烴為低碳數正構烷烴，高碳數正構烷烴中奇數碳向偶數碳正構烷烴演化規律，平均降油率為64%;F1菌株還能較好地促使五環三萜類化合物立體構型中不穩定構型向穩定性構型轉化。

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