特異性IgG抗體在異種/同種異株瘧原蟲感染治愈后P.y17XL再感染中的保護(hù)作用

秦曉松，王慶輝，劉軍，馮永輝，曹雅明

(1.中國醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院檢驗科，遼寧沈陽110004;2.中國醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院免疫學(xué)教研室，遼寧沈陽110001)

瘧疾是目前對人類健康危害最為嚴(yán)重的原蟲感染性疾病之一。最新的統(tǒng)計資料顯示，全球100多個國家的33億人口生活于瘧疾風(fēng)險區(qū)，每年有近百萬人因罹患瘧疾而死亡。為此，世界衛(wèi)生組織(WHO)等已將其列為優(yōu)先防治的三大感染性疾病之一［1］。瘧疾流行的顯著特征之一是瘧疾流行區(qū)的人群普遍存在2種或2種以上瘧原蟲的混合感染，以及同種異株或異種瘧原蟲蟲株的再感染現(xiàn)象［2-3］。因此，研制開發(fā)有效的瘧疾疫苗和抗瘧新藥已成為瘧疾治療迫切需要解決的重點(diǎn)課題。然而，當(dāng)前國內(nèi)外關(guān)于再感染的研究多集中于疫苗靶位的篩選和抗瘧藥物的開發(fā)［4-5］，而宿主保護(hù)性免疫應(yīng)答的相關(guān)機(jī)制迄今尚未系統(tǒng)闡明。瘧原蟲混合感染可使其感染進(jìn)程和宿主的免疫應(yīng)答模式明顯有別于單一瘧原蟲感染［6］。研究表明，瘧原蟲蟲株之間存在交叉抗原，其刺激機(jī)體產(chǎn)生的抗體對不同瘧原蟲的再感染具有一定的交叉保護(hù)效應(yīng)。為此，本研究通過用P.y17XL蟲株再攻擊不同瘧原蟲初次感染治愈的小鼠，監(jiān)測原蟲血癥及生存期，并檢測了再感染小鼠血清中特異性抗體的水平，旨在明確初次感染治愈產(chǎn)生的抗體對同/異種瘧原蟲再感染的保護(hù)效應(yīng)，以期為瘧疾疫苗開發(fā)及抗瘧新藥的研制提供必需的前提依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物和瘧原蟲6～8周、雌性BALB/c小鼠由中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院實驗動物研究所提供(許可證編號:SCXK京2007-0001);P.yoelii17XL(P.y17XL)、P.yoelii17XNL(P.y17XNL)、P.c chabaudi AS(P.cAS)、P.berghei ANKA(P.b ANKA)、P.vinckei(P.v)(日本愛媛大學(xué)分子寄生蟲學(xué)教研室惠贈)。

1.1.2 實驗動物感染BALB/c小鼠經(jīng)腹腔分別感染1×106P.y17XNL、P.cAS、P.bANKA或P.v寄生的紅細(xì)胞(pRBC)，待初次感染后3 d，經(jīng)口給予青蒿琥脂片(購自桂林南藥股份有限公司)60 mg/kg體重，氯喹(購自上海中西藥業(yè)有限公司)90 mg/kg體重，1次/d，連續(xù)3 d。小鼠經(jīng)尾靜脈采血，制備薄血膜，Giemsa染色，光學(xué)顯微鏡計數(shù)紅細(xì)胞感染率，原蟲血癥為0認(rèn)為小鼠治愈。上述治愈小鼠分別記為P.y17XNL immunized、P.c immunized、P.b immunized及P.v immunized組，正常未經(jīng)感染的小鼠為control組。留取部分未治療小鼠(10只)用以觀察存活率。

1.2 方法

1.2.1 血清收集和脾細(xì)胞培養(yǎng)再感染P.y17XL小鼠分別于感染后第0天和第4天，通過眼球取血收集血液，分離血清，用于檢測特異性IgG、IgG1和IgG2a抗體。并同時常規(guī)無菌取出小鼠脾臟，用RPMI1640培養(yǎng)液制備濃度為1×107個/mL脾細(xì)胞懸液，于24孔培養(yǎng)板中培養(yǎng)48 h后，收集培養(yǎng)上清，-80℃保存，用于IFN-γ檢測。

1.2.2 細(xì)胞因子檢測雙抗體夾心ELISA試劑盒檢測脾細(xì)胞培養(yǎng)上清中IFN-γ產(chǎn)生水平。酶標(biāo)儀測定450 nm處OD值。結(jié)果以試劑盒提供的標(biāo)準(zhǔn)品繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，應(yīng)用SoftMax Pro 4.3.1Ls軟件分析，計算細(xì)胞因子含量(pg/mL)。

1.2.3 P.y17XL抗原的制備感染1×106P.y 17XL的BALB/c小鼠血液(原蟲血癥約達(dá)30%)通過滅菌纖維素CF11除去白細(xì)胞，用PBS稀釋感染血液至10%壓積，經(jīng)45%Percoll(體積比)分離、收集P.y17XL感染紅細(xì)胞，要求WBC≤5個/10油鏡視野，感染率≥60%［7］。感染血樣經(jīng)皂甙裂解、-80℃冷凍30 min，40℃水浴解凍，反復(fù)凍融3次，PBS洗3次，P.y17XL顆粒抗原冰浴條件下超聲處理，設(shè)置電壓450 V，共超聲粉碎15次，每次20 s，每次間隔90 s，離心，上清即為P.y17XL可溶性抗原，經(jīng)核酸蛋白分析儀測蛋白質(zhì)含量，置-80℃冰箱備用。

1.2.4 血清特異性抗體檢測以P.y17XL可溶性抗原(10 μg/mL)包被酶標(biāo)板，100 μL/孔，4℃過夜，5%FCS封閉1 h，洗滌后加入1∶200稀釋的抗血清，37℃2 h。洗滌后加入HRP-羊抗鼠IgG或IgG1、IgG2a(1∶500)100 μL/孔，37℃1 h，洗滌。加OPD-H2O2底物顯色15 min，2 mol/L H2SO4終止反應(yīng)。酶標(biāo)儀檢測492 nm處OD值。1.2.5統(tǒng)計學(xué)處理應(yīng)用SPSS 11.5統(tǒng)計學(xué)分析軟件。雙尾student-t檢驗分析比較各組均值的顯著性差異，P＜0.05為差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 再感染小鼠原蟲血癥水平及其生存率

如圖1所示，小鼠經(jīng)不同蟲株初次感染并治愈，在再感染P.y17XL后第2～5天，P.c、P.b、P.v組小鼠的外周血紅細(xì)胞感染率逐漸升高，除P.c組外，其余2組的原蟲血癥的峰值水平均低于P.y17XL初次感染鼠(control);而同種異株的P.y17XNL組小鼠可完全抵御P.y17XL再感染，其外周血中紅細(xì)胞感染率始終為0，所有小鼠全部存活，而P.c和P.v組小鼠于再感染后7～9 d全部死亡，再感染后20 d P.b組小鼠的存活率為50%(圖1)。

圖1 P.y17XL再感染后的原蟲血癥水平和生存率Fig.1 Parasitemia and survival rate of BALB/c mice reinfected with P.y17XL

2.2 再感染小鼠脾細(xì)胞培養(yǎng)上清中IFN-γ水平

圖2 不同蟲種感染小鼠經(jīng)P.y17XL再攻擊后脾細(xì)胞培養(yǎng)上清中IFN-γ水平Fig.2 IFN-γ levels in different species/strains immunized mice after P.y17XL re-infection

與正常小鼠相比，control(初次感染P.y17XL)小鼠脾細(xì)胞培養(yǎng)上清中IFN-γ水平于再感染后第3天顯著升高(P＜0.01)，第5天水平下降，但仍然顯著高于感染前水平(P＜0.01);P.c、P.v及xnl immunized組的IFN-γ也呈現(xiàn)出相同的趨勢。同時，與control相比，初次感染不同蟲種/株感染治愈后再感染P.y17XL的小鼠，IFN-γ水平在再感染后3 d和5 d均顯著降低(P＜0.05)(圖2)。

2.3 再感染小鼠特異性IgG抗體水平檢測

如圖3所示，再感染P.y 17XL后，與control相比，P.xnl immunized組小鼠血清中P.y17XL特異性IgG水平出現(xiàn)有意義升高(P＜0.05)，最高滴度為1∶1 600;P.v immunized組為1∶800;而其他各組血清在不同滴度下，與control相比，特異性IgG抗體水平均未見顯著差異(圖3A)。與control相比，P.y17XL再感染后，P.b、P.c及P.y xnl immunized組小鼠血清中P.y17XL特異性IgG1抗體水平出現(xiàn)顯著增加(P＜0.05)，其中P.y xnl immunized組的最高滴度為1∶6 400，P.b和P.v immunized組的最高滴度為1∶800，P.c immunized組的最高滴度為1∶1 600(圖3B)。

圖3 不同蟲種感染后P.y17XL再攻擊小鼠血清中P.y17XL特異性IgG(A)，IgG1(B)水平Fig.3 Specific anti-P.y17XL IgG levels in different species/strains immunized mice after P.y17XL re-infection

3 討論

研究表明，瘧疾感染的有效控制依賴于早期Th1型免疫應(yīng)答的建立，以及隨后向Th2型免疫應(yīng)答轉(zhuǎn)化［8］。相關(guān)研究顯示，P.y17XL再感染前，小鼠血清中存在一定水平的特異性抗體，這使得小鼠對同種瘧原蟲再攻擊具有顯著的保護(hù)力，而在再感染早期，Th1型細(xì)胞因子IFN-γ出現(xiàn)一定程度的升高，血清中特異性IgG抗體水平則升高明顯，同時易感的BALB/c小鼠接受被動轉(zhuǎn)移再感染小鼠的免疫血清后可明顯抵御P.y17XL的感染［9］。由此提示，以IgG抗體為主的體液免疫應(yīng)答在宿主抵抗瘧原蟲再感染中發(fā)揮重要作用。IgG2a和IgG1分別是Th1和Th2型細(xì)胞依賴抗體，也是抗瘧免疫中最重要的IgG亞型，宿主對不同蟲種/株的抵抗或易感與宿主產(chǎn)生的IgG2a和IgG1水平明顯相關(guān)［10-11］。不同種/株瘧原蟲感染后發(fā)生再感染的現(xiàn)象已成為瘧疾疫苗研發(fā)和效果評估的主要障礙之一。然而，有關(guān)不同種株瘧原蟲感染后對同/異種株再感染的影響目前尚不明晰。

本研究顯示，P.y17XNL瘧原蟲感染治愈后能夠完全保護(hù)宿主抵抗P.y17XL的再攻擊。提示經(jīng)初次感染后的小鼠治愈后對同種瘧原蟲的再感染有完全的保護(hù)力;以異種瘧原蟲感染BALB/c小鼠治愈后，再用P.y17XL再攻擊時，與P.y17XL初次感染鼠相比，除P.c外的各組小鼠均出現(xiàn)了不同程度的蟲血癥水平降低，部分生存率有所延長。由此表明，瘧原蟲初次感染對異種瘧原蟲的再感染具有一定抵抗力，該免疫保護(hù)可能與不同蟲種瘧原蟲間存在共同的交叉抗原有關(guān)。除P.b ANKA感染組外，P.c AS和P.v組小鼠均未能完全保護(hù)宿主抵抗P.y17XL再感染，P.c AS組小鼠甚至出現(xiàn)了較高的死亡率。有文獻(xiàn)報道，單一蟲種/株瘧原蟲感染并不能誘導(dǎo)產(chǎn)生足夠的交叉免疫保護(hù)［12-13］，本實驗結(jié)果與之相符。另外，在檢測脾細(xì)胞培養(yǎng)上清中IFN-γ水平及其血清中特異性IgG抗體時發(fā)現(xiàn)，不同蟲種/株感染治愈后P.y17XL再感染的小鼠IFN-γ水平均明顯低于同時間點(diǎn)P.y17XL初次感染的小鼠;P.v、P.y 17XNL感染治愈小鼠血清中P.y17XL特異性IgG抗體水平出現(xiàn)顯著增加，且以IgG1亞類升高為主;此外，P.v和P.c AS感染治愈組的IgG1亞類也出現(xiàn)了有意義的升高，但各組的IgG2a亞類水平則未出現(xiàn)有意義的變化(數(shù)據(jù)未顯示)。這表明，P.b ANKA、P.c AS、P.v和P.y17XNL感染產(chǎn)生的抗血清均可與P.y17XL可溶性抗原產(chǎn)生明顯的交叉反應(yīng)，且該反應(yīng)主要表現(xiàn)為Th2型細(xì)胞因子介導(dǎo)的IgG1應(yīng)答水平的升高，由此提示，以IgG尤其是IgG1抗體為主的體液免疫應(yīng)答對同種異株瘧原蟲再感染發(fā)揮保護(hù)性作用，而對異種瘧原蟲再感染保護(hù)性作用有限。這也為抗瘧疫苗及抗瘧新藥在瘧疾流行區(qū)的應(yīng)用提供了理論依據(jù)。

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