鹽酸小檗堿眼用固體脂質納米粒的研究*

李佳瑋，趙海南，郭秀君，Aggrey MO，劉志東，李 楠，李 琳，潘衛三

鹽酸小檗堿眼用固體脂質納米粒的研究*

李佳瑋，趙海南，郭秀君，Aggrey MO，劉志東，李 楠，李 琳，潘衛三

[目的]制備鹽酸小檗堿固體脂質納米粒。[方法]采用乳化蒸發低溫固化法制備鹽酸小檗堿納米粒，采用離體角膜透過實驗對其體外進行評價。[結果]制備的納米粒的包封率為51.1%，平均粒徑為（19±2）nm，zeta電位為-11.5 mV，表觀滲透系數為（1.46±0.45）×10-6cm/s，與對照組相比增加了 16%，差異有統計學意義（P<0.05）。[結論]所用制備工藝簡單，可用于制備鹽酸小檗堿固體脂質納米粒。

鹽酸小檗堿；固體脂質納米粒；離體角膜透過

為解決傳統眼用液體制劑的生物利用度較低的缺點，國內外研究了一系列新型給藥系統，如納米粒、脂質體、微乳等[1-3]。

黃連為傳統中藥，在歷代中醫文獻中多見配伍黃連治療各類眼病的方劑，常用于目赤腫痛、眼目紅腫等。黃連的有效成分為生物堿，其中小檗堿的含量最高，以鹽酸鹽的狀態存在于黃連中[4]。實驗以鹽酸小檗堿（BER）為模型藥物，采用生物相容性好的脂質材料作為載體制備了固體脂質納米粒（SLN），對其處方組成、制備工藝和體外角膜透過性進行了較為全面的研究和評價。

1 材料與儀器

TK-20A型透皮擴散實驗儀（上海鍇凱科技貿易有限公司）；TK-6H型透皮擴散實驗儀（上海鍇凱科技貿易有限公司）；Milli-Q超純水系統（Millipore，美國）；AX205電子天平（Mettler toledo，瑞士）；1200型安捷倫高效液相色譜儀（Agilent，美國）；Nano ZS型激光散射粒徑分析儀（英國Malvern公司）。

鹽酸小檗堿（天津中醫藥大學制藥廠，>99%）；山崳酸甘油酯（ATO888，Gattefosse，法國）；Myrj52（遼陽奧克納米材料有限公司）；卵磷脂（PC-50，中國），其他試劑均為分析純。

新西蘭白色家兔，雌雄兼用，體質量2.0～3.0 kg[由中國醫學放射所提供，動物合格證號：SCXK（京）2010-0004]，兔舍溫度為（19±1）℃，濕度為（50±5）%。相關研究遵照動物實驗原則進行，并得到天津中醫藥大學動物研究室的支持，實驗操作過程得到天津中醫藥大學動物倫理委員會的認可。

2 方法與結果

2.1 鹽酸小檗堿固體脂質納米粒的研究

2.1.1 鹽酸小檗堿納米粒的制備 精密稱取處方量的鹽酸小檗堿、加入一定量Myrj52，在75℃恒溫瓶中用18 mL去離子水溶解，作為水相，同時稱取處方量的卵磷脂，用6 mL無水乙醇75℃溶解；處方量的ATO888用1 mL氯仿75℃溶解，并與卵磷脂溶液混合作為油相，磁力攪拌，同時將油相緩慢加入水相，揮發至總體積1/3處，過0.22膜，放入4℃冰箱2 h。

2.1.2 包封率的測定 采用高效液相色譜（HPLC）法，色譜柱為DiamondDIKMAODSC18（200mm×4．6mm，5μm），流動相為乙腈-磷酸鹽水溶液（（30∶70，pH3.0），流速為1 mL/min，柱溫為30℃，檢測波長為346 nm，進樣量為20μL。標準曲線方程為A=36.44C-1.729 9，在 0.5～30.0 μg/mL 范圍線性關系良好（r=0.999 8）。

分別選取低中高 3 個濃度 5、10、20 μg/mL 溶液，做日內精密度、日間精密度，峰面積（RSD）都小于2%，符合精密度要求。

精密量取鹽酸小檗堿固體脂質納米粒，稀釋后，加入30 kD超濾管，4 000 r/min離心30 min，取上清液，經0.45 μm微孔濾膜過濾，取續濾液用高效液相色譜法（HPLC）測定樣品中的游離藥物。精密量取鹽酸小檗堿固體脂質納米粒，加無水乙醇定容超聲破壞，超聲1 h后，4 000 r/min離心30 min，精密量取一定量上清液，樣品經0.45 μm微孔濾膜過濾，取續濾液用HPLC進行測定，用外標一點法計算藥物濃度。包封率（EE%）＝（1－C游離藥物/C總藥物）×100%。

2.1.3 處方優化 處方優化后，確定最佳處方為鹽酸小檗堿 10 mg，ATO888 80 mg，Myrj52 600 mg，卵磷脂90 mg，去離子水18 mL，無水乙醇5 mL，氯仿1 mL，制備的納米粒的包封率為51.1%。

2.1.4 粒徑及zeta電位測定 按上述處方制備的鹽酸小檗堿固體脂質納米粒，分別測定粒徑和zeta電位。平均粒徑為（19±2）nm。zeta電位為-11.5mV，見圖 1、圖 2。

2.2 鹽酸小檗堿固體脂質納米粒家兔離體角膜透過實驗

2.2.1 實驗裝置 本實驗所用裝置為改進的Franz立式擴散池：由兩個等內徑的供給池和接受池組成，供給池容積為0.5 mL，接受池容積為4.5 mL，內半徑為0.4 cm，有效擴散面積為0.50 cm2。

2.2.2 離體角膜透過實驗 家兔耳緣靜脈注射空氣，致死。在死后20 min內用眼科手術剪和鑷子小心分離出角膜，除去鞏膜、虹膜、睫狀體等多余組織。將新鮮離體角膜小心固定在Franz擴散池的供給池和接受池之間，使上皮層面向供給池，在接受池中加入新鮮配制的谷胱甘肽——碳酸氫鈉林格溶液（GBR）[5]4.5 mL，在供給池中加入含0.1%鹽酸小檗堿固體脂質納米粒和鹽酸小檗堿溶液1 mL。裝置置于透皮擴散實驗儀中，攪拌子約6 mm，轉速（200±25）r/min，溫度控制在（35±1）℃。實驗開始后，分別在 40、80、120、160、200、240 min 從接受池中取樣4.5 mL，同時補充等體積同溫的GBR溶液，樣品經0.45 μm微孔濾膜過濾后，用HPLC測定。

2.2.3 數據處理 單位面積累積透過量Q可由下式求算。

其中Cn為t時間藥物的測定濃度，Ci為t時間前的測定濃度，V0為接受池中溶液體積，V為取樣體積。

表觀滲透系數（Papp，cm/s）定義為：

其中C0為供給池初始藥物濃度；A為有效透過面積；△Q/△t可由累積透過量－時間曲線穩態部分的斜率求得。

表觀滲透系數以兩獨立樣本t檢驗進行統計學分析，P<0.05為差異有統計學意義。

2.2.4 樣品測定 色譜條件同2.2.2項，標準曲線方程為A=0.146C-1.440 6，在25～1 000 ng/mL范圍線性關系良好（r=0.999 6）。

分別選取低中高3個濃度50、100、500 ng/mL溶液做日內日間精密度，RSD都小于2%，符合精密度要求。

2.2.5 結果 本實驗以鹽酸小檗堿溶液為對照，考察鹽酸小檗堿固體脂質納米粒（BER-SLN）的角膜透過性。鹽酸小檗堿離體角膜透過參數見表1、表2。

表1 鹽酸小檗堿眼用固體脂質納米粒家兔角膜透過性（±s，n=3）

表1 鹽酸小檗堿眼用固體脂質納米粒家兔角膜透過性（±s，n=3）

40 min 80 min 120 min 160 min 200 min 240 min對照組 0.56±0.25 1.41±0.59 2.59±1.12 3.89±1.69 6.04±2.44 08.30±2.81 Q=0.038 4t-1.583 3 0.965 8 BER-SLN 組 0.73±0.38 2.05±0.81 3.79±1.37 5.91±2.12 7.94±2.39 10.29±3.37 Q=0.048 3t-1.641 8 0.992 3組別 藥物的累積透過量（μg/cm2） 線性關系 r2

表2 鹽酸小檗堿眼用固體脂質納米粒離體角膜透過參數（±s，n=3）

表2 鹽酸小檗堿眼用固體脂質納米粒離體角膜透過參數（±s，n=3）

注：與對照組比較，*P<0.0 5。

組別Papp×106cm/sJss×103μg/（s·cm2）對照組 1.26±0.44 1.28±0.45 BER-SLN 組 1.46±0.45* 1.61±0.50*

由表2可知，鹽酸小檗堿固體脂質納米粒中鹽酸小檗堿的表觀滲透系數Papp增加了16%，與對照組比較差異有統計學意義（P<0.05）。

3 討論

固體脂質納米粒的制備方法有很多，主要有高壓均質法、薄膜-超聲分散法、熱融分散法、乳化-沉淀法、溶劑乳化法等，高壓均質法制備固體脂質納米粒適合工業化生產[6]。通過單因素考察了硬脂酸、單硬脂酸甘油酯、三硬脂酸甘油酯、山崳酸甘油酯，最終選定脂質材料為山崳酸甘油酯，表面活性劑Myrj52，結果大豆卵磷脂和Myrj52一起使用效果較好，本實驗采用乳化蒸發低溫固化法制備，實驗結果證明該處方及工藝切實可行。

[1]Monika Y，Munish A.Preparation and evaluation of nanoparticles of gum cordial,an anionic polysaccharide for ophthalmicdelivery[J].CarbohydratePolymers,2010(81):871-877.

[2]Cortesi R,Argnani R,Esposito E,et al.Cationic liposomes as potential carriers for ocular administration of peptides with anti-herpetic activity[J].International Journal of Pharmaceutics,2006,31(7):90-100.

[3]Alany RG,Rades T,Nicoll J,et al.W/O microemulsions for oculardelivery:Evaluation ofocular irritation and precorneal retention[J].Journal of Controlled Release,2006,11(1):145-152.

[4] 李 琳，趙海南，李佳瑋，等．鹽酸小檗堿離子型眼用原位凝膠的研究[J].天津中醫藥大學學報，2011，30（4）：229-231.

[5] Rojanesekul Y,Robinson JR.Transport mechanisms of the cornea.Characterizatim of barrier permselectivity[J].Int J Pharm,1989,55(2):237-246.

[6] 徐元龍，李學明，張 琪，等．固體脂質納米粒的研究新進展[J].中國新藥雜志，2005，14（7）：838－843．

Preparation of ophthalmic solid lipid nanoparticles loading berberine hydrochloride

LI Jia-wei1,ZHAO Hai-nan1,GUO Xiu-jun1,Aggrey MO1,LIU Zhi-dong1,LI Nan1,LI Lin1,PAN Wei-san2
（1.Tianjin Modern Chinese Medicine Key Laboratory-Province and Ministry Co-established State Key Laboratory Cultivation Base,Engineering Research Center of Modern Chinese Medicine Discovery and Preparation Technique,Ministry of Education,Tianjin University of TCM,Tianjin 300193,China;2.Shenyang Pharmaceutical University,Shenyang 110016,China）

[Objective]To prepare ophthalmic solid lipid nanoparticles loading berberine hydrochloride.[Methods]The solid lipid nanoparticles loading berberine hydrochloride were prepared by emulsification-ultrasonic method.The isolated cornea permeation test of the formulation was studied in rabbit.The permeated amount of berberine hydrochloride was determined by high performance liquid chromatography.[Results]The entrapment efficienciesof nanoparticlewas 51.1%.The average partic1e size was(19±2)nm.The zeta potential was-11.5 mV.The transparent coefficient of the formulation was(1.46±0.45)×10-6cm/s,increased for 16%when compared with control(P<0.05).[Conclusion]The preparation technique is simple and stable,which could be used to prepare the solid lipid nanoparticles loading berberine hydrochloride.

berberine hydrochloride;solid lipid nanoparticle;cornea permeation in vitro

R285

A

1673－9043（2012）03－0157-03

國家自然基金項目（81001645）；中國博士后科學基金項目（20090460701）。

300193 天津中醫藥大學，天津市現代中藥重點實驗室-省部共建國家重點實驗室培育基地，現代中藥發現與制劑技術教育部工程研究中心（李佳瑋，趙海南，郭秀君，Aggrey MO，劉志東，李 楠，李 琳）110016 沈陽藥科大學（潘衛三）

李佳瑋（1981-），女，博士，實驗師，主要從事眼用制劑的研究。*

潘衛三。

2012-03-18）

·研究生園地·