噪聲對小鼠耳蝸外側壁縫隙連接蛋白 Connexin31表達的影響*

王亞菲 王娟 張鵬志 米文娟 蔣興旺 王潔 邱建華

研究表明，過度的噪聲刺激會損傷耳蝸內、外毛細胞、螺旋神經節以及螺旋韌帶，從而引起暫時性閾移或永久性閾移。縫隙連接廣泛存在于機體各組織細胞間，具有維持內環境穩態及進行細胞間物質交換的作用。它由相鄰兩細胞胞膜上的半通道對接而成，而半通道由六個縫隙連接蛋白組成。研究報道，縫隙連接蛋白通過其配體對縫隙連接的調節及組裝發揮作用[1]，此外還具有改變細胞增殖、分化及抗損傷的能力[2,3]。在耳蝸外側壁細胞間也存在縫隙連接，其不僅作為維持內環境穩態及胞間物質交換的通道，而且對維持內淋巴電位及促進鉀離子內淋巴循環發揮重要作用[4,5]。本研究觀察噪聲致聾后耳蝸聽覺功能障礙與縫隙連接蛋白Connexin31(Cx31)之間的關系，為探討噪聲性聾的發病機制提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1動物及分組 采用成年雄性Balb/c小鼠44只(購自第四軍醫大學實驗動物中心)，體重約8～11 g，隨機分為噪聲組和對照組，每組各22只。噪聲組小鼠給予高強度白噪聲暴露(115 dB SPL，6 h/d，共2天，12 h)，對照組不予噪聲暴露。

1.2主要試劑 兔抗小鼠Cx31多克隆抗體(Invitrogen, USA)，Cy3標記山羊抗兔IgG(康維世紀)，5%正常山羊血清封閉液(武漢博士德)，Trizol(Invitrogen, USA)，反轉錄試劑采用PrimeScript?RT Master Mix Perfect Real Time(TaKaRa)，熒光實時定量PCR試劑采用SYBR?Premix Ex TaqTM II Perfect Real Time(TaKaRa)，以GAPDH為內參照，引物由寶生物工程公司設計，序列如下： Gjb3上游5’-cgggtgctggtgtatgtggt -3’，下游5’-gatgttggagatggggaagaag -3’；GAPDH上游5’-tgtgtccgtcgtggatctga-3’，下游5’-ttgctgttgaagtcgcaggag-3’。

1.3主要儀器 電熱恒溫培養箱，正置熒光顯微鏡(OLYMPUS)，動物噪聲刺激箱，冰凍切片機(LEICA CM1850)，ABR儀(Bio-logic SYSTEMS CORP)，實時定量PCR擴增儀(Bio-Rad IQ5)。

1.4建立小鼠噪聲性聾模型 噪聲組22只小鼠放在特制鼠籠中，每只小鼠都有獨立空間，不會聚集在一起以免影響造聾效果。將鼠籠放入動物噪聲刺激箱中，動物噪聲刺激箱連接聲音放大器，噪聲由電腦軟件產生并控制，每次給予噪聲前均用校準器進行校準。噪聲設置為白噪聲，強度115 dB SPL，每天6小時共2天。

1.5ABR檢測 于兩組小鼠實驗前及噪聲暴露結束后1小時檢測ABR反應閾。具體方法如下：于靜電屏蔽室內，小鼠腹腔注射2%戊巴比妥深度麻醉后，將記錄電極置于前額正中皮下，參考電極置于待測耳后皮下，接地電極置于尾部皮下。給予click聲刺激，疊加1 024次，刺激率為每秒13次，濾波帶寬為100～3 000 Hz。測試從90 dB SPL開始，降幅為5 dB，以引出波Ⅲ的最小刺激強度為ABR反應閾。

1.6冰凍切片制備 噪聲暴露后4小時，取噪聲組及對照組小鼠各4只，用2%戊巴比妥腹腔注射麻醉，經4%多聚甲醛心臟灌注后取出耳蝸，解剖顯微鏡下去除鐙骨，挑破圓窗膜及卵圓窗膜，用玻璃吸管向窗內反復吹吸，浸入4%多聚甲醛液內4 ℃過夜，常規脫鈣脫水后，行冰凍切片，片厚10 μm。

1.7間接免疫熒光染色 冰凍切片晾干后經0.01 M PBS清洗，滴加5%正常山羊血清封閉液室溫放置1小時；滴加兔抗小鼠Cx31多克隆抗體(1：250)后4 ℃過夜。翌日用0.01 M PBS清洗后避光滴加Cy3標記山羊抗兔IgG(1：800)，并置于37 ℃孵育40 min；0.01 M PBS清洗后避光滴加Hochest(1:1 000)襯染胞核；陰性對照以0.01 M PBS代替一抗，其余步驟同上。甘油封片后熒光顯微鏡下觀察，胞膜呈明亮的紅色熒光為表達陽性，根據其紅色熒光的明亮程度來判斷表達的強弱。

1.8熒光實時定量PCR 小鼠行ABR檢測后，在噪聲暴露后4小時內，將噪聲組及對照組小鼠各18只頸椎脫臼處死，立即于冰上取出耳蝸外側壁組織，取出后迅速放入預冷的Trizol中。組織稱重使噪聲組和對照組的組織量相近，分別抽提總RNA并進行核酸定量。各組樣本均吸取1 μl總RNA，分別加入反轉錄體系中合成cDNA，隨后各樣本分別以1 μl cDNA為反應模板，加入SYBR Premix Ex Taq II 10 μl，上游及下游引物各0.5 μl，dH2O 8 μl，進行熒光實時定量 PCR反應。反應條件：95 ℃ 30 s，95 ℃ 10 s，60 ℃ 30 s，95 ℃ 60 s，55 ℃ 60 s，55 ℃ 20 s，循環40次。本實驗以管家基因GAPDH在小鼠耳蝸外側壁的mRNA表達量為內參照，采用相對定量的2—△△Ct方法對數據加以分析，檢測兩組小鼠耳蝸外側壁Cx31編碼基因GJB3的mRNA表達量。

1.9統計學方法 實驗數據用SPSS18.0統計軟件進行t檢驗，熒光實時定量PCR數據的收集主要由PCR擴增儀自帶軟件完成，最終比較各組樣本GJB3/GAPDH的相對表達量。

2 結果

2.1ABR反應閾 實驗前兩組小鼠的ABR反應閾差異無統計學意義(P>0.05)，噪聲暴露后噪聲組小鼠ABR反應閾分別與噪聲暴露前和對照組差異有統計學意義(均為P<0.01)(表1)。

表1 兩組小鼠實驗前、后ABR反應閾

注：與同組實驗前及對照組實驗后比較，P<0.01

2.2間接免疫熒光染色觀察 熒光顯微鏡下可見，對照組小鼠耳蝸外側壁內有Cx31表達，Cx31特異性熒光主要集中表達在螺旋韌帶的Ⅰ型纖維細胞，部分Ⅲ型纖維細胞也有表達，在表達密集處會融合成斑片狀，血管紋內未見陽性表達。噪聲組小鼠耳蝸螺旋韌帶處可見Cx31特異性熒光，但明顯低于正常組(圖1、2)。

圖1 對照組小鼠耳蝸外側壁免疫熒光染色(×400)

Cx31主要表達在與血管紋毗鄰的螺旋韌帶Ⅰ型纖維細胞，在部分Ⅲ型纖維細胞也有表達。在表達密集處會融合成斑片狀。在血管紋處未見特異性熒光

圖2噪聲組小鼠耳蝸外側壁免疫熒光染色(×400)

螺旋韌帶處特異性熒光明顯減弱，只有少量Ⅰ型纖維細胞表達Cx31

2.3熒光實時定量PCR 結果顯示，噪聲組小鼠GJB3/GAPDH相對表達量為0.170 5±0.091 5，對照組GJB3/GAPDH相對表達量為1.369 6±0.302 7，對照組是噪聲組的8倍。噪聲組小鼠耳蝸外側壁GJB3的平均表達量較對照組明顯降低，兩者差異有統計學意義(P<0.01)。

3 討論

縫隙連接蛋白是一種膜蛋白，廣泛存在于各種組織中，它具有四個跨膜區，其C端長度具有高度變異性。六個縫隙連接蛋白在內質網和/或高爾基體中經寡聚化后形成一個半通道，經胞內的微管泡網絡轉運至胞質膜[6]，從而與相鄰細胞形成縫隙連接。這六個連接蛋白可以相同也可以不同，同型的半通道可以相互對接形成縫隙連接，也可以選擇性的與異型的半通道對接，這種特殊的組合方式使縫隙連接蛋白很可能具有連接作用以外的其他功能。細胞間的縫隙連接中間形成微管，允許離子如Ca2+、Mg2+、K+通過，以及分子量小于1 KDa的小分子通過，如ATP、cAMP、cGMP、IP3等。縫隙連接的通道由縫隙連接蛋白構成，目前已知在哺乳類動物中，人類有21種縫隙連接蛋白，小鼠有20種[7]。

目前，關于Cx31的研究主要集中在Cx31突變引起的聽力障礙以及變異性紅斑角化病(EKV)，而在Cx31未突變的情況下，噪聲致聾后耳蝸功能障礙與Cx31之間有何種相互作用尚不清楚。本實驗觀察到Cx31在正常成年小鼠耳蝸中有表達，Cx31主要表達在與血管紋毗鄰的螺旋韌帶Ⅰ型纖維細胞，在部分Ⅲ型纖維細胞也有表達；給予噪聲刺激后，Cx31在Ⅰ型纖維細胞的表達減少，在Ⅲ型纖維細胞幾乎沒有表達，這與文獻[8～10]中報道的結論一致。Spicer等[11]的觀察結果顯示，在沙鼠耳蝸外側壁有Na,K-ATP酶、碳酸酐酶和肌酸激酶等離子轉運調節酶表達，Ⅰ型和Ⅲ型纖維細胞均沒有Na,K-ATP酶表達，而只表達碳酸酐酶和肌酸激酶。因此推測，螺旋韌帶的縫隙連接，尤其是與血管紋毗鄰的部分螺旋韌帶中的縫隙連接在離子轉運中發揮了重要作用。

文獻報道，持續高強度噪聲刺激會損傷耳蝸內、外毛細胞，最終導致聽閾位移。本實驗參照文獻[12,13]中常用的噪聲暴露條件，并適當延長暴露時間，結果顯示，噪聲暴露前噪聲組與對照組小鼠的ABR閾值差異無統計學意義(P>0.05)，而在給予高強度噪聲后，噪聲組的ABR閾值升幅達到45 dB，明顯高于對照組(P<0.01)，說明本實驗采用的噪聲暴露條件建立小鼠噪聲性聾成功，且造成的閾移短期內不易恢復。

縫隙連接在細胞間形成孔道，使相鄰細胞間可以直接進行物質交換及胞間通訊，因而在維持內環境穩態中有重要作用。在內耳中，縫隙連接參與了內淋巴電位(EP)的產生和維持。內耳中存在兩套縫隙連接系統，一個是上皮組織縫隙連接系統，主要由Corti器支持細胞、骨螺旋板緣的齒間細胞(interdental cell)和螺旋韌帶的根細胞(root cell)組成；另一個是結締組織縫隙連接系統，由血管紋中間細胞、血管紋基底細胞、螺旋韌帶纖維細胞、連接聽泡骨質的間質細胞、間質暗細胞和骨螺旋板緣的纖維細胞組成[14,15]。關于鉀離子內淋巴循環在EP產生中的作用，有學者提出，鉀離子離開毛細胞后，通過上皮細胞縫隙連接系統進入毛細胞外側的其它Corti器細胞中，經螺旋韌帶的Ⅱ型纖維細胞攝入后，通過結締組織細胞縫隙連接系統進入血管紋，隨后被分泌入內淋巴[16]。文中結果顯示，噪聲暴露后小鼠耳蝸外側壁Cx31表達量明顯下降，其表達量僅為對照組的1/8，結合形態學觀察結果，推測噪聲引起了耳蝸外側壁的縫隙連接系統功能障礙，從而影響鉀離子的循環途徑，進而引起EP改變。而Cx31究竟在上述過程中發揮何種作用及如何發揮作用有待進一步研究。

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