蒙古族耳聾患者中常見致聾基因突變分析

鮑曉林 郭家亮 郭玉芬

耳聾基因在遺傳性聾患者中具有較高的遺傳異質性，在不同地區和不同人群中耳聾基因的突變頻率、突變方式和熱點突變有很大差異。目前普遍認為GJB2基因、SLC26A4基因、線粒體DNA12Sr RNA是常見的致聾基因，也是中國耳聾人群中突變攜帶率最高的致病基因，而且不同地域、不同民族也有其自身的特點，但國內相關研究絕大部分是在漢族人群中進行的，對少數民族耳聾人群中常見耳聾基因的分子流行病學研究相對較少。我國是多民族的國家，隨著聾病基因篩查工作的不斷深入，越來越多的少數民族聾病資源被發現，為了探討不同民族聾病常見基因突變特點，了解常見耳聾基因突變在不同民族間的分子流行病學特點，揭示少數民族耳聾患者的遺傳學機制，制定個性化的基因篩查和聾病分子診斷流程，本研究對耳聾分子流行病學調查中發現的64例蒙古族耳聾先證者資料進行分析，以了解蒙古族人群耳聾基因的分布特點。

1 資料與方法

1.1研究對象 蒙古族非綜合征型聾患者64例，其中男34例，女30例，年齡7～21歲，中位年齡13歲，語前聾54例，語后聾6例(小于或等于2歲者判定為語前聾，2歲以后出現的聽力下降者判定為語后聾)，余4例發病年齡不明確。有氨基糖苷類抗生素應用史23例(占36.4%)，有耳聾家族史6例(9.4%)。根據世界衛生組織《障礙、殘疾和殘廢的國際分類》(1997)對語言頻率聽力損失劃分標準分級：輕度聾(聽力損失26～40 dB HL)、中度聾(41～60 dB HL)、重度聾(61～80 dB HL)、極重度聾(>81 dB HL)及全聾，64例中，重度聾24例，極重度聾40例。

排除標準：有典型的慢性化膿性中耳炎表現、聽力檢查為傳導性聽力下降或有中耳手術史，有較重的顱腦外傷或耳外傷史，綜合征型聾，中樞性疾病、腦癱等智力障礙引起的語言障礙患者。

1.2調查方法 對64例患者進行全身及耳鼻咽喉科常規檢查，并進行純音聽閾、中耳功能ABR和耳聲發射等檢查，判斷是否存在蝸后病變。在知情同意的前提下，抽取外周靜脈血5 ml，制備基因組DNA，應用紫外分光光度計檢驗樣本純度，并建立耳聾基因數據庫[1,2]。

1.3實驗方法 針對GJB2基因在第二個外顯子的編碼區進行擴增[3]，引物序列為GJB2-F：GGTGTTTGCTCCAGGAAGA, GJB2-R：GGCCTACAGGGGTTTCAAAT，PCR產物片段大小為843 bp。用25 μl PCR反應體系在ABI公司9700熱循環儀完成。反應條件：10×Buffer 2.5 μl ，dNTP(2.5 mM/ul)2 μl ,20 μM/μl primers 0.5 μl ,rTag酶0.5 μl ，100 ng DNA Template 1 μl ，ddH2O 18 μl 。反應條件：94 ℃預變性5 min,94 ℃變性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s,30個循環，反應結束后再72 ℃延伸7 min,4 ℃保存。產物經測序檢測突變。

針對線粒體1555位點設計引物，F:TGCTTACCCAGACTCGAGAA，R: CGACTGAGCCTTGACAGCTGA，PCR產物片段大小為801 bp。PCR反應采用25 μl 反應體系，10×Buffer 2.5 μl ，2.5 μM dNTP2 μl ，20(M primers 0.5 μl ，rTaq酶0.5 μl ，100 ng DNA Template 1 μl ，ddH2O 18 μl。反應條件：95 ℃預變性5 min，95 ℃變性30 s，58 ℃退火45 s，72 ℃延伸45 s，30個循環，反應結束后再72 ℃延伸7 min，4 ℃保存，產物送測序檢測突變。

SCL26A4基因突變分析方法：應用解放軍總醫院國家北方基因研究中心的20對引物序列和反應條件[4]，分別進行擴增反應，然后取PCR產物和標準Marker各2 μl ，分別加入6 μl 溴酚藍，用1.5%瓊脂糖凝膠進行產物純度和濃度的檢測，產物送測序檢測突變。

2 結果

GJB2基因：235delC純合突變2例(圖1)，299-300delAT和176-191del 16bp(圖2)復合雜合突變1例，235delC與176-191del 16bp復合雜合突變1例，478G>A/wt雜合突變1例，79G>A和/或341A>G遺傳多態性改變31例，占48.4%。突變率為7.81%(5/64)，等位基因攜帶率為5.46%(7/128)。

mtDNA12SrRNA 1555和1494位點未發現突變。

圖1 235delC突變測序圖：純合突變(中)、雜合突變(上)、正常對照(下)

圖2 299-300delAT突變測序圖：雜合突變(下)、正常對照(上)，序列方框標識為缺失的16個堿基位置

圖3 SLC26A4基因IVS7-2A>G突變測序圖：正常對照(下)、雜合突變(上)、純合突變(中)

SLC26A4基因：919-2A>G/919-2A>G純合突變4例(圖3)；復合雜合突變4例，分別為2027 T>A/919-2A>G 2例、2169A>G/919-2A>G 2例；雜合突變7例，分別為919-2A>G/wt 4例，918+1delG/wt、1238G>A/wt和2027 T>A/wt各1例。突變率為23.44% (15/64)，等位基因攜帶頻率為17.99%(23/128)。

本組64例患者中共檢測出GJB2、SLC26A4、線粒體DNA12SrRNA三種基因突變者20例，其中SLC26A4基因突變率最高(75%，15/20)，其中919-2A

3 討論

我國地域遼闊，民族眾多，各地區經濟和意識形態的發展極不均衡，少數民族的遺傳背景存在明顯的差異性。針對全國不同區域、不同民族的耳聾人群進行深入的研究，掌握確鑿的聽力學和遺傳學數據，明確少數民族耳聾基因突變的頻率、特定耳聾基因突變和多態性特點等，能夠為耳聾基因篩查和基因診斷提供詳細的參考依據，制定個性化的遺傳咨詢服務，指導優生優育。

蒙古族主要集中聚居在內蒙古自治區，在河北、遼寧、吉林、黑龍江以及新疆等省自治區也有蒙古族聚居區。本組64例蒙古族耳聾患者均來自在內蒙古自治區，從病史、發病年齡、聽力學特點來看無特異性。本組中蒙古族耳聾患者的三種常見耳聾基因突變的發生率與文獻報道的漢族和其他少數民族的常見耳聾致病基因突變頻率分布有所不同[5～8]，235delC基因突變攜帶率4.7%(3/64)，是本組中GJB2基因最多見的突變位點，占全部突變的15%(3/20)； SLC26A4基因919-2A>G是突變檢出率最高的位點，突變攜帶率為18.6%(12/64)，占全部突變的60%(12/20)，三種常見致病基因中SLC26A4基因是本組中突變率最高的，占全部突變的75%，其次為GJB2基因(25%)，而線粒體DNA 12SrRNA 1555位點和1494位點均未檢測到突變。可見耳聾基因突變有明顯的種族差異，而且突變頻率有較大的地域差異[5，6]。蒙古族和漢族同屬于蒙古人種，除外種族起源和始祖效應的因素，分析其原因還有以下幾點：一是本組觀察的樣本量較少，難免造成統計結果的偏差，還需要擴大樣本量，進行更深入的研究證實；二是本實驗未統計與藥物性聾相關的961和7445等位點；三是由于遺傳異質性、遺傳漂變和先證者效應等遺傳學的不確定因素，還可能存在基因修飾或其他尚未發現的調節因素。由于長期進化形成各人種間的遺傳差異，人群的大規模遷移、不同種族之間的婚配、融合又使得不同種群的遺傳背景變得更為復雜，從而造成了不同地域、不同民族、不同種群之間的遺傳學特點各不相同。遺傳學的始祖效應和遺傳漂變的原因使得遺傳信息發生聚集或遺傳力降低，從而出現了遺傳攜帶頻率的變化。蒙古族人線粒體基因研究能否成為耳聾基因研究的突破口，還需要更深入的探索，期望通過對蒙古族人的致聾基因的研究，從分子水平上認識蒙古族人在遺傳素質上與其他種族的不同，為更好的開展基因診斷和治療提供指導。

4 參考文獻

1 王秋菊, 韓東一, 郭玉芬, 等. 遺傳性耳聾的資源收集保存及基因定位克隆與分子流行病學研究[J]. 中國耳鼻咽喉-頭頸外科雜志, 2006,13:661.

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3 鮑曉林，郭玉芬,劉曉雯.29個近親結婚致聾核心家系GJB2、SLC26A4和線粒體DNA12SrRNA基因分析[J].聽力學及言語疾病雜志,2008,16:92.

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