EGFP－線粒體蛋白導(dǎo)入載體的構(gòu)建及功能驗(yàn)證

喬錄新，張玉林，丁 渭，陳德喜

(首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京佑安醫(yī)院感染科，北京100069)

EGFP－線粒體蛋白導(dǎo)入載體的構(gòu)建及功能驗(yàn)證

喬錄新，張玉林，丁 渭，陳德喜*

(首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京佑安醫(yī)院感染科，北京100069)

目的 構(gòu)建能夠?qū)⑼庠吹鞍讓?dǎo)入真核細(xì)胞線粒體的真核表達(dá)載體，并且通過增強(qiáng)型綠色熒光蛋白的表達(dá)進(jìn)行示蹤。方法 利用多重PCR擴(kuò)增法將線粒體導(dǎo)肽序列與EGFP序列融合在一起，并插入真核表達(dá)載體pcDNA3.1，構(gòu)建成真核表達(dá)載體pcDNA5.1-EGFP。將P53基因分別插入pcDNA5.1-EGFP和pcDNA3.1構(gòu)建成pcDNA5.1-P53和pcDNA3.1-P53載體。經(jīng)酶切和測(cè)序驗(yàn)證后在脂質(zhì)體介導(dǎo)下分別將上述載體轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，一方面在熒光顯微鏡下比較綠色熒光蛋白與細(xì)胞色素C在細(xì)胞內(nèi)的分布情況，另一方面通過免疫熒光法比較P53蛋白在細(xì)胞內(nèi)的定位。結(jié)果 綠色熒光的表達(dá)分布與細(xì)胞色素C具有一致性，且轉(zhuǎn)染pcDNA5.1-P53載體的細(xì)胞內(nèi)P53蛋白集中在胞質(zhì)線粒體中，而轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-P53載體的細(xì)胞內(nèi)P53蛋白主要分布在細(xì)胞核內(nèi)。結(jié)論 成功構(gòu)建能夠?qū)⑼庠吹鞍讓?dǎo)入線粒體的真核表達(dá)載體。

表達(dá)載體;綠色熒光蛋白;線粒體導(dǎo)肽

線粒體是真核細(xì)胞重要的細(xì)胞器，是人體的動(dòng)力工廠，無論是細(xì)胞的成活(氧化磷酸化)和細(xì)胞死亡(凋亡)均與線粒體功能有關(guān)，特別是呼吸鏈的氧化磷酸化異常與許多人類疾病有關(guān)。自從Luft等［1］首次報(bào)道1例線粒體肌病以來，因線粒體功能障礙導(dǎo)致的疾病已累及全身多個(gè)系統(tǒng)，其中以神經(jīng)系統(tǒng)和肌肉系統(tǒng)受累表現(xiàn)突出，近年來有發(fā)現(xiàn)線粒體與各種腫瘤的發(fā)生有密切關(guān)系［2］。……