慢性乙型肝炎病毒耐藥突變體研究

陳俊意，朱照靜，張如超，楊治國，蔣洪輝，鄧才彬，譚麗，黃曉可

(重慶醫藥高等?？茖W校重慶醫學生物技術研究所/臨床醫學系，重慶400030)

乙型肝炎病毒(hepatitis B virus，HBV)是引起病毒性肝炎的主要病原體［1-5］，由HBV所引起的乙型病毒性肝炎是嚴重危害我國人民健康的傳染病。我國慢性乙肝病毒感染者占全世界的1/4，拉米夫定(lamivudine)和阿德福韋雙酯(adefovir dipivoxil)是目前廣泛用于治療慢性乙型肝炎的核苷類似物藥物，這2種藥物可以在單一治療或在聯合治療中使用。但由于耐藥HBV病毒株的出現，治療效果常常不能持久。有些患者在治療中或治療后觀察到肝炎突然發作，可再次檢測到HBV DNA，使得乙型病毒性肝炎治療成功率一直不高［6-10］。臨床研究表明，用于臨床治療的核苷(酸)類似物產生的耐藥是由于HBV發生了突變，進而導致藥物抑制病毒復制的作用明顯減弱。因此在新的抗病毒藥物投入臨床使用之前，對HBV耐藥突變體進行篩選，對耐藥的分子機制進行研究，變得更加迫切。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 病例重慶腫瘤醫院40歲男性患者1名，HBsAg陽性、HBeAg陽性，該患者以前未接受抗病毒治療，入院后用抗病毒核酸類藥物治療。最開始用拉米夫定治療16周，而后用拉米夫定和阿德福韋混合治療16周。

1.1.2 血清收集和相關指標測定分別于0、18、22、60和70周收集患者血清。測定丙氨酸氨基轉移酶(glutamate-pyruvate transaminase，ALT)及HBV DNA滴度，均利用商業試劑盒按照臨床要求測定。直接測序確定HBV基因型。

1.2 方法

血清中HBV DNA提取按照試劑盒說明書(Omega，America)進行，反應體系總體積30 μL，20 mmol/L Mg2+3 μL、2 mmol/L dNTP 3 μL、10×buffer 3 μL、引物3 μL、模板3 μL、Tag酶0.2 U，用去離子水(DH2O)補足體積。用一對外引物(P1、P2)進行第1輪PCR，P1為5'-AAGGGTATCTTGCCCGTTTGTCGTA-3'，P2為5'-AAGCAGGATAGCCACAGA-3'，擴增條件:94℃預變性5 min，94℃變性30 s、55℃退火30 s、72℃延伸60 s，36個循環后，72℃再延伸10 min，第1輪產物為模板，以引物P3(5'-AAGGCACTTGTATTCCCATCCGAG-3')和P4(5'-AAGGTCTATTTACAGGGGA-3')進行第2輪PCR。擴增條件:94℃預變性5 min，94℃變性30 s、56℃退火30 s、72℃延伸30 s，36個循環后，72℃再延伸5 min。最后將PCR產物分別在3%瓊脂糖中進行電泳，同時加入Marker通過產物片段的大小來判斷基因型。

2 結果與分析

2.1 患者血清HBV的DNA滴度測定

慢性乙肝病毒感染者血清HBV的DNA滴度是反映HBV病毒多少的一項重要指標。由圖1可知，患者入院后，血清HBV的DNA滴度在18周為最高，以后逐步下降，在60周時最低，后又稍微升高。

圖1 患者血清HBV的DNA滴度Fig.1 HBV DNA counts

圖2 患者丙氨酸轉移酶活性Fig.2 Alamine aminotransferase(ALT)concentrations

2.2 患者血清丙氨酸轉移酶活性

患者血清丙氨酸轉移酶活性是衡量慢性乙肝病毒感染者利用核苷酸類似物治療結果的重要生物化學指標，由圖2可知，患者血清丙氨酸轉移酶活性在18周為最高，以后逐步下降，22周后保持在較低水平。

2.3 患者血清HBV突變體

在該名慢性乙肝病毒感染者利用核苷酸類似物治療的過程中，篩選到了其血清中HBV突變體。由表1可知，在病人入院未治療即0周的時候，發現2個突變體M204V和T213T;在拉米夫定治療期間，在18周和22周分別檢測到突變體LMV rtH69T(YMDDlocus)和LMV rtT184T(YMDDlocus)、LMV rtM204I(YMDDlocus)。在60周和70周分別檢測到ADV T213S、ADV T222A、ADV K212T和ADV S196L、ADV S242H，其中ADV S196L和ADV S242H 2種突變體是首次檢測到。

表1 不同治療階段血清樣品中突變體分析(數值為相應克隆比值，%)Table 1 Evolution ofdrug resistant mutatios on clonal analysis of serial samples.Values are relative of clones(%)

3 討論

在利用核苷類似物藥物拉米夫定和阿德福韋雙酯治療慢性乙型肝炎的過程中，隨著治療手段的進步，HBV病毒迫于環境選擇壓力，也在不斷地突變和進化，從而抑制了慢性乙型肝炎患者的治愈率，縮短了患者存活時間，臨床上至今無法解決這一難題。同時增加了慢性乙型肝炎患者的治療成本，延長了治愈時間。

從本實驗可以看出，患者在0周沒有開始治療之前就已經有了2個突變體M204V和T213T，說明患者作為被感染者，HBV病毒抗核苷類似物突變體就已經在其他患者身上存在，可能是作為傳染源患者在接受核苷類似物治療的時候，HBV病毒就已經發生突變。在18、22和60周篩選出的患者HBV病毒突變體，其他研究者以前均發現過。而在70周篩選出的患者HBV病毒突變體ADV S196L和S242H，以前沒被發現過，說明在生存環境變化的條件下，HBV病毒的突變是不定向的，這給治療慢性乙型肝炎新藥物研制帶來了極大的困難。

檢測HBV耐藥突變的方法，有基因芯片技術和PCR產物直接測序等。拉米夫定和阿德福韋雙酯是目前被批準并廣泛應用于治療慢性乙型肝炎的核苷類似物藥物，拉米夫定和阿德福韋致使HBV產生相關的耐藥位點。臨床研究表明，由于HBV聚合酶氨基酸序列發生了突變，使得藥物與HBV聚合酶的親和力下降，這是產生核苷(酸)類似物耐藥的根本原因，進而導致藥物抑制病毒復制的作用明顯減弱。盡管有許多內外因素，如臨床用藥方式不當、患者年齡、感染時間長短、性別差異等影響慢性乙型肝炎的治療效果，但HBV產生耐藥突變體仍然是慢性乙型肝炎患者治療失敗的最重要因素。現有抗病毒藥物還很少，因此慢性乙型肝炎的臨床治療還需要新藥的投入。

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