抗乙型肝炎病毒表面抗原T7噬菌體抗體庫的構(gòu)建

劉兵，馬曉宇，李響，羅恩杰

(1.中國醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病原生物教研室，遼寧沈陽110001;2.中國醫(yī)科大學(xué)96期七年制臨床專業(yè)，遼寧沈陽110001;3.沈陽醫(yī)學(xué)院奉天醫(yī)院藥劑科，遼寧沈陽110024)

乙型肝炎是由乙型肝炎病毒(Hepatitis B Virus，HBV)引起的，乙型肝炎是世界范圍公認(rèn)的重要傳染病。有調(diào)查表明，全球約20億人被證明曾感染過HBV，3～4億人為HBV慢性感染，其中25%～40%最終將死于肝硬化和肝癌，每年死于乙型肝炎的患者大約為100萬人左右［1-2］。因此，研究乙型肝炎的治療具有重要的實(shí)際意義。目前，常用的治療慢性乙型肝炎藥物有α干擾素、拉米夫定、阿德福韋及恩替卡韋等［3-4］，其作用有效，但也都有副作用，由于慢性乙型肝炎具有長期性、難治性、進(jìn)展性和復(fù)發(fā)性的特點(diǎn)，現(xiàn)有的抗HBV治療藥物還難以徹底清除患者體內(nèi)的HBV，因此，乙型肝炎治療依然是困擾醫(yī)學(xué)工作者的一項(xiàng)難題。乙型肝炎病毒表面抗原(Hepatitis B surface antigen，HBsAg)是一種糖蛋白，由HBV的S基因編碼，能夠刺激機(jī)體產(chǎn)生保護(hù)性抗體抗-HBs。單鏈抗體(single-chain fragment of variable region，scFv)具有穿透力強(qiáng)、容易到達(dá)靶細(xì)胞及在治療時(shí)不會(huì)引起免疫排斥反應(yīng)等優(yōu)點(diǎn)，如與毒素連接可直接攻擊病毒感染細(xì)胞，達(dá)到治療病毒感染的目的。構(gòu)建T7噬菌體單鏈抗體(scFv)庫篩選抗HB-sAg抗體，可以為表達(dá)出小分子的抗HBsAg單鏈抗體，并將scFv與毒素連接，為最終探索出一種新的治療方法治療HBV感染奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 抗-HBs陽性患者全血5例抗-HBs陽性恢復(fù)期患者全血，采自沈陽市第五人民醫(yī)院。

1.1.2 主要試劑T7 Select10-3噬菌體載體試劑盒購自Novagen公司;RT-PCR試劑盒、Taq酶、限制性內(nèi)切酶、T4DNA連接酶為TaKaRa公司產(chǎn)品;引物由TaKaRa公司合成;RNAlock、RNAout、凝膠回收試劑盒購自天澤公司;辣根過氧化物酶購自羅氏公司;HBsAg抗原購自貝爾公司;其余試劑均為分子生物學(xué)純級(jí)。

1.2 方法

1.2.1 抗-HBs陽性恢復(fù)期患者外周血淋巴細(xì)胞的分離5位肝素抗凝抗-HBs陽性恢復(fù)期患者的外周血，各取5 mL混勻，加于5 mL淋巴細(xì)胞的分離液上，室溫2 500 r/min離心10 min，吸取淋巴細(xì)胞層，然后PBS洗滌2次。

1.2.2 細(xì)胞總RNA提取收集外周血淋巴細(xì)胞，用RNAlock保護(hù)RNA，用RNAout提取總RNA，經(jīng)異丙醇沉淀，70%乙醇洗滌，然后溶于無RNA酶的H2O中。

1.2.3 cDNA第1條鏈合成參照RT-PCR兩步法試劑盒說明書，在10 μL反應(yīng)體系中，加500 ng總RNA為模板，以oligo(dT)為引物，合成抗體重鏈可變區(qū)(VH)基因和輕鏈可變區(qū)(VL)基因的cDNA第1條鏈，最后99℃，5 min，滅活逆轉(zhuǎn)錄酶。

1.2.4 PCR擴(kuò)增抗體可變區(qū)基因參照文獻(xiàn)［5-7］，設(shè)計(jì)并合成人抗體可變區(qū)基因的簡并引物。VH抗體基因5'端簡并引物:5'-TGGGT GAATTC TCAGGTGCAGCTGSWGSAGTCWGG-3'，VH抗體基因:3'端簡并引物5'-ACCCGAGCCACCACCGCCCGAGCCACCGCCACCTGAGGAGACGGTGACCRKKGTYCC-3'，并在VH抗體基因5'端簡并引物中引入限制性內(nèi)切酶EcoRⅠ酶切位點(diǎn)，劃線部分為EcoRⅠ酶切位點(diǎn)。VL抗體基因5'端簡并引物:5'-TCGGGCGGTGGTGGCTCGGGTGGCGGCGGATCAGAWRTTGTGMTGACKCAGTCTCC-3'，VL抗體基因3'端簡并引物:5'-GCAGC AAGCTT TCGTTTGATMTCCASYTTKGTCCC-3'，并在VL抗體基因3'端簡并引物中引入限制性內(nèi)切酶HindⅢ酶切位點(diǎn)，劃線部分為HindⅢ酶切位點(diǎn)。以上4個(gè)引物中，Y=C或T，R=A或G，W=A或T，S=C或G，K=T或G，M=A或C。以cDNA第1條鏈為模板，分別擴(kuò)增VH抗體基因和VL抗體基因，在50 μL反應(yīng)體系中，加Mg2+至終濃度2.0 mmol/L，加dNTP至終濃度0.2 mmol/L，加Taq酶2.5 U，加可變區(qū)5'端簡并引物和可變區(qū)3'端簡并引物均為20 pmol/L。反應(yīng)條件:94℃變性4 min，然后進(jìn)入循環(huán)，94℃變性30 s，56℃退火30 s，72℃延伸1 min，共30個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸10 min。分別擴(kuò)增VH和VL基因。

1.2.5 SOE PCR拼接scFv抗體基因在100 μL反應(yīng)體系中，取擴(kuò)增的VH抗體基因和VL抗體基因各2 μL作為模板，加Mg2+至終濃度2.0 mmol/L，加dNTP至終濃度0.2 mmol/L，加Taq酶5 U，混勻后進(jìn)入拼接循環(huán)，反應(yīng)條件:94℃變性4 min，然后進(jìn)入循環(huán)，94℃變性30 s，62℃退火30 s，72℃延伸1 min，共擴(kuò)增7個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸10 min，使VH和VL基因通過編碼連接肽(Gly4Ser)3基因連接。在上述反應(yīng)體系中，補(bǔ)加VH5'端引物和VL3'端引物各40 p mol/L(終濃度)，再次PCR擴(kuò)增，反應(yīng)條件:94℃變性30 s，56℃退火30 s，72℃延伸1 min，共25個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸10 min。

1.2.6 酶切、回收scFv基因并與載體連接以凝膠回收試劑盒回收SOE PCR擴(kuò)增的scFv基因，以EcoRⅠ和HindⅢ雙酶切scFv基因，然后進(jìn)行凝膠電泳，紫外燈下切下scFv基因所在凝膠，凝膠回收試劑盒回收酶切后的scFv基因。將EcoRⅠ和HindⅢ雙酶切的scFv基因與EcoRⅠ和HindⅢ雙酶切的T7 Select10-3噬菌體載體的2個(gè)arm按1∶4的摩爾數(shù)比混合，T4DNA連接酶16℃連接4 h。

1.2.7 T7噬菌體抗體庫的構(gòu)建連接反應(yīng)產(chǎn)物5 μL與T7噬菌體包裝提取物25 μL混合，室溫包裝2 h，加入270 μL LB液體培養(yǎng)基，終止反應(yīng)，建立T7噬菌體抗體庫，取少量噬菌體稀釋，鋪板測(cè)定包裝效率。隨機(jī)選取10個(gè)噬斑，接種于宿主菌BLT5403，增殖后提取DNA，加VH5'端引物和VL3'端引物，PCR擴(kuò)增scFv基因，計(jì)算scFv基因插入率。將宿主菌BLT5403接種于3 mL含Amp的M9TB液體培養(yǎng)基中，37℃180 r/min搖床培養(yǎng)，至OD值約為0.8，接種包裝產(chǎn)物，繼續(xù)培養(yǎng)至發(fā)生溶菌，加入5 mol/L NaCl并12 000 r/min離心10 min去雜質(zhì)，加入50%PEG 8000并12 000 r/min離心10 min沉淀噬菌體，LB液體培養(yǎng)基重懸沉淀，取少量噬菌體梯度稀釋，鋪板測(cè)定抗體庫的滴度。

1.2.8 T7噬菌體抗體庫的篩選用TBS稀釋HB-sAg抗原至1 μg/mL，以稀釋HBsAg抗原4℃過夜包被酶標(biāo)板，5%BSA封閉包被板。在酶標(biāo)板中加入T7噬菌體抗體庫，室溫孵育30 min，TBST洗滌5次，1%SDS室溫孵育20 min，洗脫抗體庫，所得噬菌體抗體即為次級(jí)噬菌體抗體庫，以次級(jí)噬菌體抗體庫感染宿主菌BLT5403擴(kuò)增后，可用于下一輪篩選。滴定次級(jí)噬菌體抗體庫的滴度，并計(jì)算每一輪篩選噬菌體產(chǎn)出/投入比(回收率)作為特異性噬菌體抗體富集的指標(biāo)，重復(fù)上述步驟4次。

1.2.9 抗HBsAg抗原單克隆噬菌體抗體活性檢測(cè)第4輪篩選所得抗體庫鋪板形成噬菌斑，隨機(jī)選取噬菌斑，感染BLT5403宿主菌，擴(kuò)增后得到單克隆噬菌體抗體。以NaCl和PEG 8000純化抗HBsAg單克隆噬菌體抗體。參照文獻(xiàn)［8］，制備酶標(biāo)抗體，以0.1 mol/L pH 5.0硼酸溶液充分溶解單克隆噬菌體抗體和辣根過氧化物酶，逐滴加入1%戊二醛溶液，混勻，室溫反應(yīng)2 h，以偶聯(lián)辣根過氧化物酶和噬菌體抗體，加過量10%甘氨酸封閉未反應(yīng)的戊二醛，室溫反應(yīng)4 h，得到抗HBsAg抗原的單克隆酶標(biāo)噬菌體抗體。同時(shí)，將野生T7噬菌體與辣根過氧化物酶偶聯(lián)，作為陰性對(duì)照。將抗HBsAg抗原的單克隆酶標(biāo)噬菌體抗體和陰性對(duì)照稀釋后，分別加入HBsAg抗原包被的酶標(biāo)板，37℃孵育1 h，TBST洗滌5次，加0.1 mol/L pH 5.0檸檬酸鈉-磷酸緩沖液溶解的鄰苯二胺和H2O2底物，37℃反應(yīng)15 min，2 mol/L H2SO4終止反應(yīng)，在492 nm波長用酶標(biāo)儀檢測(cè)OD值，樣品A492/陰性對(duì)照A492＞2者，為陽性。

2 結(jié)果與分析

2.1 T7噬菌體抗體庫的構(gòu)建

噬菌體抗體庫構(gòu)建后，取少量噬菌體稀釋鋪板，測(cè)定DNA包裝效率為1.7×107/μg。隨機(jī)挑取10個(gè)噬菌斑，在宿主菌BLT5403內(nèi)擴(kuò)增，提取T7噬菌體DNA，用scFv兩端簡并引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，其中9份DNA擴(kuò)增出約800 bp的scFv基因，scFv基因的插入率為90%，其庫容為1.53×107。重組噬菌體擴(kuò)增后，得到滴度為2.42×1010pfu/mL的初級(jí)噬菌體抗體庫(圖1)。

圖1 噬斑試驗(yàn)測(cè)定T7噬菌體抗體庫滴度Fig.1 Detecting the titer of T7 library by plaque assay

2.2 T7噬菌體抗體庫的富集篩選

表1 HBsAg抗原對(duì)噬菌體抗體庫的富集Table 1 Enrichment of T7 library by HBsAg

用HBsAg抗原對(duì)噬菌體抗體庫進(jìn)行4輪“吸附-洗脫-擴(kuò)增”的篩選，每次滴定篩選前及篩選后的噬菌體抗滴度，計(jì)算噬菌體加入量和噬菌體回收量，并計(jì)算回收率。回收率=噬菌體回收量/噬菌體加入量，洗脫的噬菌體滴度呈明顯增加趨勢(shì)，噬菌體抗體得到約50倍的富集(表1)。

2.3 T7噬菌體抗體活性鑒定

隨機(jī)挑取第4輪篩選產(chǎn)物20個(gè)克隆，制備單個(gè)克隆噬菌體抗體。并將單個(gè)克隆噬菌體抗體與辣根過氧化物酶偶聯(lián)，與HBsAg抗原包被的酶標(biāo)板特異性反應(yīng)，經(jīng)鄰苯二胺和H2O2底物顯色，H2SO4終止反應(yīng)，492 nm波長用酶標(biāo)儀檢測(cè)OD值，樣品A492/陰性對(duì)照A492＞2者，為陽性。檢測(cè)結(jié)果顯示，20株噬菌體抗體中17株具有抗原特異性結(jié)合活性，其中有2株具有較高的抗原特異性結(jié)合活性(圖2)。

圖2 酶免疫試驗(yàn)鑒定T7噬菌體抗體活性(部分結(jié)果)Fig.2 Identification of T7 individual clones by enzyme immunoassay(part of results)

3 討論

在構(gòu)建抗體庫擴(kuò)增scFv基因時(shí)，本研究設(shè)計(jì)簡并引物，用1對(duì)重鏈可變區(qū)引物擴(kuò)增出大部分重鏈可變區(qū)基因，用1對(duì)輕鏈可變區(qū)引物擴(kuò)增出大部分輕鏈可變區(qū)基因［6］，既最大限度地?cái)U(kuò)增出了多樣的抗體基因，又減少了引物的使用，簡化了操作，節(jié)約了時(shí)間，這是本研究與其他研究的最大不同之一。另外，在設(shè)計(jì)引物時(shí)還參考了Yang［7］的研究，在重鏈可變區(qū)的羧基端基因和輕鏈可變區(qū)的氨基端基因引入編碼連接肽(Gly4Ser)3序列，通過SOE PCR法直接將VH基因和VL基因拼接成scFv，簡化了基因重組過程，使操作更為方便。

在選擇噬菌體載體時(shí)，沒有選擇常用的M13絲狀噬菌體展示系統(tǒng)，而是選用了最近幾年新問世的T7噬菌體載體。相比傳統(tǒng)的M13絲狀噬菌體，T7噬菌體具有更多的優(yōu)點(diǎn)。T7噬菌體極為穩(wěn)定，能在各種嚴(yán)酷的條件下不被破壞，這使洗脫過程操作更為簡單，本研究洗脫T7噬菌體時(shí)，就直接采用1%SDS室溫孵育20 min的簡潔方法，結(jié)果非常理想。另外，T7噬菌體生長極為迅速，形成噬斑僅需3 h，而且整個(gè)擴(kuò)增過程不需要輔助病毒，一般大約5 h即可完成一輪“吸附-洗脫-擴(kuò)增”，大大縮短研究周期。在構(gòu)建抗體庫時(shí)，選擇了免疫抗體庫而沒有選擇天然抗體庫，也就是抗體基因來自恢復(fù)期患者，這樣更容易選出高親和力的抗體，而且抗體庫的庫容也不用做得很大，節(jié)約了材料和時(shí)間。

本研究運(yùn)用噬菌體抗體庫技術(shù)構(gòu)建了庫容量為1.53×107，滴度為2.42×1010pfu/mL的初級(jí)噬菌體抗體庫，酶免疫實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，2株scFv噬菌體抗體與HBsAg抗原可特異性結(jié)合。本研究為下一步對(duì)所獲克隆株進(jìn)行序列分析、可溶性抗體表達(dá)和純化以及獲得的抗體應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)，并有希望最終將可溶性scFv抗體與毒素連接，探索出治療HBV感染的新方法。

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