生物肽SP對NK細胞活化性受體NCRs表達的影響

傅煒昕，秦博，顧鵬毅，黃勤俊，梁再賦

(中國醫科大學實驗技術中心一部暨國家中藥管理局中藥生物工程科研Ⅲ級實驗室，遼寧沈陽110001)

神經內分泌系統對機體免疫功能具有重要的調控作用。生物肽P物質(Substance P，SP)不僅是一種重要的神經遞質，而且還是神經系統、內分泌系統和免疫系統共同的化學語言［1］。中樞神經系統的神經元和神經膠質細胞是SP的主要來源，而免疫細胞是SP的另一來源。外周神經末梢釋放SP參與免疫調節和炎癥過程，免疫細胞產生的SP則以自分泌或/和旁分泌的方式調節免疫細胞的功能，已有實驗證明SP可從多方面影響各種免疫細胞［2-3］。自然殺傷細胞(Naturalkillercells，NK細胞)是先天性免疫系統的重要組成部分，是機體抗御感染和防止細胞惡性轉化的重要免疫細胞。NK細胞功能的發揮主要依賴于NK細胞能表達多種與主要組織相容性抗原(MHC)和非MHC類配體結合的受體，而傳遞的抑制或激活信號，NK細胞的活化取決于激活信號與抑制信號的平衡［4-5］。已發現的NK細胞表面的活化性受體包括自然細胞毒受體(Natural cytotoxicity receptors，NCRs)、NKG2D、活化殺傷免疫球蛋白樣受體(Killer immunogloblin-1ike receptors，KIRs)及其他輔助刺激活化性受體2B4、DNAM-1、NTB-A、CD59等［4］。目前，關于SP對NK細胞生物學功能的調控及作用機制的研究，國內外報道較少，且其作用機制尚未明確。本研究以非IL-2依賴的NK92-MI細胞株為對象，研究SP對NK92-MI細胞殺傷活性的影響，并測定SP對NK92-MI細胞活化性受體NCRs(NKp46、NKp44和NKp30)的表達的影響，以闡明SP對NK細胞殺傷功能的調節作用機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 材料α-MEM培養基(Invitrogen)，馬血清及胎牛血清(Hyclone)，SP(Sigma)。

1.1.2 試劑Trizol試劑(Invitrogen)，Real-Time PCR反應試劑盒(TaKaRa)，流式細胞抗體(APCNKp46單抗、PE-NKp30單抗、NKp44單抗，R＆D)。

1.1.3 主要儀器流式細胞儀(BD)，PCR儀(MJ Research Inc)，Real-Time PCR System(ABI PRISM)。

1.2 方法

1.2.1 MTT法測定SP對NK92-MI細胞殺傷活性的影響取對數生長期的NK92-MI細胞(4×105/mL)，接種于96孔培養板(100 μL/孔)用不同濃度的SP(10－14、10－12、10－10、10－8、10－6mol/L)刺激24 h，作為效應細胞;以K562細胞為靶細胞，效靶細胞共同孵育4 h(效靶細胞比為4∶1);加入MTT液(5 mg/mL)，再繼續孵育4 h;然后各孔吸棄上清液，加入DMSO和甘氨酸緩沖液，振蕩15～20 min;用酶標儀于570 nm處測定OD值。按下列公式計算NK92-MI細胞對K562細胞的殺傷率:

NK細胞殺傷率(%)=(1－(殺傷實驗組OD值－效應細胞對照組OD值)/靶細胞對照組OD值)×100%

1.2.2 Real-Time PCR檢測活化性受體NCRs的mRNA表達水平①引物設計:NKp44、NKp46、NKp30的引物用Primer Premier 5.0軟件設計，由金思特科技有限公司(南京)合成，各引物序列見表1;②Real-Time PCR:取對數生長期的NK92-MI細胞(約1×107個)，用不同濃度的SP(10－14、10－12、10－10、10－8mol/L)分別作用4、12和24 h，在各時間點收集細胞;用異硫氰酸胍(Trizol)法提取總RNA。RT反應體系為10 μL(細胞總RNA 1.0 μL、5×Prime Script TM Buffer 4.0 μL、Prime Script TM Enzyme MixⅠ0.5 μL、Oligo dT引物0.5 μL、隨機引物6 0.5 μL、無RNA酶H2O 3.5 μL);反轉錄反應條件為37℃、15 min(反轉錄反應)，85℃、5 s(反轉錄酶的失活);PCR反應體系為20 μL(模板cDNA 2.0 μL、SYBY Primix Ex TaqTM 10 μL、PCR上游引物0.4 μL、PCR下游引物0.4 μL、ROX Reference DyeⅡ0.4 μL、無菌H2O 6.8 μL);PCR反應為2步法:①95℃，30 s(預變性);②95℃，5 s;60℃，34 s(40個循環);應用ABI PRISM 7500 Real-Time PCR System進行檢測，以18S rRNA作參照基因，用2－ΔΔCt法比較實驗組相對表達量與對照組的倍數差異，計算公式如下:

表1 Real-Time PCR用引物Table 1 Primer sequences used in real-Time PCR

1.2.3 流式細胞術檢測NK92-MI細胞NKp44、NKp46和NKp30的膜表達取對數生長期的NK92-MI細胞(1×106/mL)，接種于6孔板，用10－14～10－8mol/L的SP作用24 h，收集細胞，用人IgG室溫封閉Fc受體(15 min);加入熒光標記單抗(PE-NKp30單抗或APC-NKp46單抗或未標記的NKp44單抗)，4℃避光孵育30～45 min;未標記的NKp44抗體還需與FITC標記的二抗再孵育30 min。細胞重懸于含0.5%BSA的PBS緩沖液中，上流式細胞儀檢測。

1.2.4 統計學分析所得實驗數據均以均數±標準差(ˉχ±SD)表示，各組間均數比較采用一維方差分析(one-way ANOVA)，P＜0.05為差異有統計學意義。應用SPSS 13.3統計分析軟件進行統計學分析。

2 結果與分析

2.1 SP對NK92-MI細胞殺傷活性的增強作用

經一定濃度(10－14～10－6mol/L)的SP作用24 h后，用MTT釋放法檢測NK92-MI細胞對K562細胞的殺傷活性。結果顯示較低濃度的SP對NK92-MI細胞的殺傷活性均顯示有增強作用(10－14mol/L組:89.74%，10－12mol/L組:95.66%，10－10mol/L組:94.6%，10－8mol/L組:88.89%)，其中10－14～10－10mol/L組與對照組(78.31%)比較，具有非常顯著性差異(P＜0.01)，10－8mol/L組具有顯著性差異(P＜0.05)。而高濃度10－6mol/L的SP對NK92-MI細胞的殺傷活性則無明顯影響。

2.2 SP增加NK92-MI細胞活化性受體NCRs的mRNA表達

選擇促殺傷活性作用較強的濃度(10－14～10－8mol/L)的SP刺激NK92-MI細胞4、12和24 h后，NCRs的mRNA表達水平用Real-Time PCR法進行測定，結果見表2和圖1。

表2 NK92-MI細胞NCRs mRNA的相對定量(ˉχ±SD)Table 2 Relative quantitation of NCRs mRNA in NK92-MI cells(ˉχ±SD)

圖1 NCRs的Real-time PCR擴增曲線圖Fig.1 Real-time PCR amplification curve of NCRs

2.2.1 SP對NKp46 mRNA表達水平的影響高濃度(10－8mol/L)SP作用4 h，NKp46的mRNA表達已開始增加;較高濃度(10－10～10－8mol/L)SP作用12 h，NKp46的mRNA表達呈增加趨勢(P＜0.05);作用24 h時，各濃度的SP均可明顯增加NKp46的mRNA水平，與對照組比較，差異性非常顯著(P＜0.01)。

2.2.2 SP對NKp44 mRNA表達水平的影響高濃度(10－8mol/L)SP作用4 h，NKp44的mRNA表達已增加(P＜0.05);較高濃度SP作用12 h，NKp44的mRNA表達亦呈增加趨勢，其中10－10～10－8mol/L組P＜0.01、10－12mol/L組P＜0.05;作用24 h時，各濃度的SP均可明顯增加NKp44的mRNA水平，與對照組比較，有非常顯著性差異(P＜0.01)。

2.2.3 SP對NKp30 mRNA表達水平的影響高濃度(10－8mol/L)SP作用12 h，NKp30的mRNA表達已明顯增加(P＜0.01);較高濃度(10－10mol/L)SP作用12 h，NKp30的mRNA表達也有所增加(P＜0.05);作用24 h時，各濃度的SP均可明顯增加NKp30的mRNA水平，與對照組比較差異非常顯著(P＜0.01)。

2.3 SP對NK92-MI細胞NKp46、NKp44及NKp30受體膜表達的影響

10－14～10－8mol/L的SP作用NK92-MI細胞24 h后，用流式細胞術檢測NKp46、NKp44及NKp30的膜表達水平，結果見表3和圖2。

表3 SP對NK92-MI細胞NCRs分子膜表達(%)的影響(ˉχ±SD)Table 3 Effects on surface expression of NCRs in NK92-MI cells by SP(ˉχ±SD)

各濃度的SP均可增加NKp46的膜表達，與對照組比較有非常顯著性差異(P＜0.01);而NKp46膜表達水平的增高隨SP濃度的升高而回落，提示SP的調節作用可能具有雙向性。僅較低濃度(10－14mol/L)的SP對NKp44的膜表達有增加作用，與對照組比較有顯著性差異(P＜0.05);同樣NKp44膜表達水平的趨勢隨SP濃度的升高而回落，高濃度(10－8mol/L)組甚至有所下降，但無統計學意義。各濃度的SP對NKp30的膜表達無明顯影響(P＞0.05)。

圖2 流式細胞儀檢測NCRs膜表達Fig.2 FACS histograms of NCRs

3 討論

SP是神經內分泌系統反應時分泌的一種生物活性多肽，廣泛分布于細的初級傳入神經纖維內。SP具有多種生理功能，且SP作為一種神經炎癥因子，與臨床的多種疾病有關。在各種生理和病理條件下，SP能以神經內分泌的方式作用于各種免疫細胞，參與免疫調節。已有一些研究證據表明SP對NK細胞的調節作用，SP可刺激外周血NK細胞的遷移和細胞毒活性，并調節炎癥部位的NK細胞分泌IFN-γ，某些疾病狀態致外周血SP濃度升高而抑制NK細胞的殺傷活性。可見，SP在不同條件下所起的作用具有復雜性和多樣性［6-7］。

NK細胞參與免疫系統的發生、發展及效應等重要環節的調節過程，是機體天然免疫的主要承擔者，也是獲得性免疫的核心調節細胞，NK細胞無需特異性抗原識別便可直接殺傷腫瘤細胞和病毒感染的細胞。NK細胞介導的殺傷病毒感染細胞或腫瘤細胞的細胞毒作用主要歸功于非HLA限制性活化性受體的表達，這類受體主要包括NCRs和NKG2D等［4，8-9］。NCRs為近年發現的一類非MHC限制的特異性啟動NK細胞活化的表面分子，屬于免疫球蛋白超家族受體，成員包括NKp46、NKp44和NKp30，其中NKp46和NKp30在所有靜止和活化的NK細胞都表達，是NK細胞組成性表達受體;NKp44僅表達于活化的NK細胞，是人類NK細胞活化的最佳標志［10-12］。NCRs以非MHC依賴性方式直接殺傷靶細胞的活性使它們與其他活化性受體(如CD2和KIR2DS)區分開來。NCRs的配體至今還未明確，但推測白血病細胞表面表達NCRs的特異性配體。NCRs也可與病毒產物相互作用，NKp46和NKp44可識別流感病毒血凝素和副流感病毒血凝素、神經酰胺酶病毒蛋白，發揮NK細胞的抗病毒效應［4，13-14］。NCRs的表達可受細胞因子、疾病狀態、藥物等的影響。NCRs在細胞表面的表達程度與NK細胞功能的發揮密切相關。目前有關SP對NK細胞功能性受體NCRs等表達的影響研究，尚少見報道。因此，對NCRs的表達情況以及SP對其表達的影響進行研究，不僅能揭示NK細胞的活化程度及功能狀態，而且將在分子水平闡釋SP對NK細胞生物學活性的調控作用及內在機制。

研究已證實生理濃度范圍的SP對NK細胞的殺傷活性有增強作用;且SP通過增加NK細胞殺傷介質(穿孔素和顆粒酶)的表達來直接調節其殺傷活性。鑒于NCRs分子與NK細胞殺傷活性的密切聯系，進一步研究SP對NK細胞NCRs表達的影響。結果顯示SP可同時增加3種活化性受體的轉錄水平，但對這些受體的膜表達的作用各不相同。推測SP可以作為一種活化因子，通過增加活化性受體NCRs的表達，來調節NK細胞的活性。其中NKp46參與這種調控作用，而與NKp30和NKp44無明顯關系，這可能是同一細胞不同活化性受體競爭表達的結果。另外，SP對NKp46和NKp44膜表達水平的上調作用隨著SP濃度的升高反而回落，提示SP對NK細胞的功能可能存在雙向調節作用。研究結果進一步揭示了SP活化NK細胞、介導其免疫功能的效應分子，將為探索提高NK細胞對腫瘤、病毒感染細胞的殺傷活性，用于細胞過繼免疫治療提供新的思路，也有助于深入理解神經系統對NK細胞生物學活性及功能的調節作用。

［1］ Butts CL，Sternberg EM.Neuroenddcrine Factors Alter Host Defencse by Modulating Immune Function［J］.Cell Immunol，2008，252(1-2):7-15.

［2］ Koon HW，Pothoulakis C.Immunomodulatory properties of substance P:the gastrointestinal system as a model［J］.Ann N Y Acad Sci，2006，1088:23-40.

［3］ Katsanos GS，Anogeianaki A，Orso C，et al.Impact of substance P on cellular immunity［J］.J Biol Regul Homeost Agents，2008，22(2):93-98.

［4］ Marras F，Bozzano F，De Maria A.Involvement of Activating NK Cell Receptors and Their Modulationin Pathogen Immunity.Journal of Biomedicine and Biotechnology［J］.J Biomed Biotechnol，2011，2011:152430.Epub.

［5］ Lanier L L.Nature killer cell receptor signaling［J］.Curr Opin Immunol，2003，15(3):308-314.

［6］ Lighvani S，Huang X，Trivedi PP，et al.Substance P regulates natural killer cell interferon-gamma production and resistance to Pseudomonas aeruginosa infection［J］.Eur J Immunol，2005，35(5):1567-1575.

［7］ Clemens Feistritzer，Johannes Clausenb，Daniel H.Sturna，et al.Natural killer cell functions mediated by the neuropeptide substance P［J］.Regul Pept，2003，116(1-3):119-126.

［8］ Papamichail M，Perez SA，，Gritzapis AD，et al.Natural killer lymphocytes:biology，development，and function［J］.Cancer Immunol Immunother，2004，53(3):176-186.

［9］ Schmitt C，Ghazi B，Bensussan A.NK cells and surveillance in humans［J］.Reprod Biomed Online，2008，16(2):192-201.

［10］ Pessino A，Sivori S，Bottino C，et al.Molecular cloning of NKp46:a novel member of the immunoglobulin superfamily involved in triggering of natural cytotoxicity［J］.J Exp Med，1998，188(5):953-960.

［11］ Pende D，Parolini S，Pessino A，et al.Identification and molecular characterization of NKp30，a novel triggering receptor involved in natural cytotoxicity mediated by human natural killer cells［J］.J Exp Med，1999，190(10):1505-1516.

［12］ Cantoni C，Bottino C，Vitale M，et al.NKp44，a triggering receptor involved in tumor cell lysis by activated human natural killer cells，is a novel member of the immunoglobulin superfamily［J］.J Exp Med，1999，189(5):787-795.

［13］ Hershkovitz O，Rosental B，Rosenberg LA，et al.NKp44 receptor mediates interaction of the envelopeglyco proteins from the West Nile and dengue viruses with NK cells［J］.Journal of Immunology，2009，183(4):2610-2621.

［14］ Joyce MG，Tran P，Zhuravleva MA，et al.Crystal structure of human natural cytotoxicity receptor NKp30 and identi?cation of its ligand binding site［J］.PNAS，2011，108(15):6223-6228.