不吸水鏈霉菌梧州新亞種膽固醇氧化酶基因的克隆與序列分析

吳紅艷，陳飛，關艷麗，方新，于淼

(遼寧省微生物科學研究院，遼寧朝陽122000)

膽固醇氧化酶(Cholesterol oxidase，CHO)是膽固醇降解代謝過程中的第一個酶。它能夠催化膽固醇生成終產物4-膽甾烯-3-酮，同時將脫下的氫與氧氣生成H2O2。在臨床上膽固醇氧化酶與膽固醇脂酶和過氧化氫酶一起作為血漿總膽固醇含量的檢測試劑，用以診斷冠心病、動脈粥樣硬化等心腦血管疾病;在食品行業常用它來降低食品中膽固醇含量，制造保健食品;同時，它又是一種新型、高效殺蟲劑，對鞘翅目、鱗翅目、雙翅目、直翅目、同翅目等害蟲都有毒殺作用，尤其對鞘翅目棉鈴象甲具有極強的毒殺能力。研究人員已經從好幾種微生物中分離到膽固醇氧化酶基因［1］，如甾短桿菌、鏈霉菌、分枝桿菌和紅球菌等。不吸水鏈霉菌梧州新亞種是由遼寧省微生物科學研究院自行篩選的、具有自主知識產權的新菌株［2］，經研究具有產生膽固醇氧化酶的能力，但是產量較低，常規的方法很難大幅度提高酶產量，所以制約了它的生產和應用。本研究目的是以不吸水鏈霉菌梧州新亞種基因組DNA作為模板［3］，利用已知的膽固醇氧化酶基因的保守序列設計簡并引物進行PCR擴增，PCR產物與載體連接、轉化，構建重組質粒，為不吸水鏈霉菌梧州新亞種膽固醇氧化酶基因的誘導表達提供可靠的實驗數據并打下良好的理論基礎［4］。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種供體菌:不吸水鏈霉菌梧州新亞種(Streptomycesahygroscopicussubsp.wuzhouensis n.subsp)，遼寧省微生物科學研究院提供;宿主菌:E.coli DH5α。

1.1.2 質粒載體PUC18。

1.1.3 培養基LB培養基。

1.1.4 試劑酶類、DNA純化試劑盒、感受態細胞制備劑、低熔點瓊脂糖等。

1.1.5 儀器高速冷凍離心機、超純水系統、PCR儀(Appolied Biosystems)、核酸電泳、紫外透射反射分析儀等。

1.2 方法

1.2.1 不吸水鏈霉菌梧州新亞種基因組DNA提取溶菌酶破壁法。

1.2.2 不吸水鏈霉菌梧州新亞種膽固醇氧化酶基因的PCR擴增引物的設計與合成［5］:利用相關的分子生物學軟件，通過分析比較GenBank中已知的膽固醇氧化酶基因序列，獲得膽固醇氧化酶基因保守序列信息［6］，設計并合成一對簡并引物，用來從不吸水鏈霉菌梧州新亞種基因組DNA中擴增膽固醇氧化酶基因片段，簡并引物序列如下:上游引物序列:5'-GG GGATCCGGAATTCGTSGGYGGSGGYTCSCTC-3'，下游引物序列:5'-CC GAATTCCGGGATCCGCTCBGCBWGMGCSGYGAT-3'。PCR擴增反應體系為20 μL，反應體系為多次試驗研究確定，模板、4NTP和引物分別為2 μL，10×PCR緩沖液2.5 μL，Taq酶0.5 μL，反應條件:94℃，30 s;71℃，3 min;30個循環，并進行瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.2.3 不吸水鏈霉菌梧州新亞種膽固醇氧化酶基因片段回收、純化應用DNA純化試劑盒［7］。

1.2.4 陽性轉化子的篩選與鑒定將PCR擴增產物用BamHⅠ、EcoRⅠ2種內切酶進行分步雙酶切，并將質粒載體PUC18同樣酶切。酶切體系為10 μL，酶切條件(分步雙酶切):溫度37℃時間2 h/步。將PCR擴增產物酶切片段與同樣酶切后的質粒載體進行連接、轉化，連接產物轉入大腸埃希菌E.coli DH5α中進行陽性轉化子的篩選，連接體系為20 μL，連接條件為4℃過夜。轉化:將連接產物轉入新制備的大腸埃希菌E.coli DH5α感受態細胞中進行陽性轉化子的藍白篩選。挑取藍白篩選中的白斑和藍斑作為對照樣品接種于液體含Amp+的LB培養基中，37℃恒溫振蕩培養24 h，提取質粒，用EcoRⅠ和PstⅠ進行雙酶切鑒定。

1.2.5 陽性轉化子的序列測定酶切鑒定正確的轉化子進行序列測定和分析［8］。

2 結果與分析

2.1 不吸水鏈霉菌梧州新亞種基因組DNA提取結果

得到足夠濃度的基因組DNA。

2.2 不吸水鏈霉菌梧州新亞種膽固醇氧化酶基因的PCR擴增結果

不吸水鏈霉菌梧州新亞種膽固醇氧化酶基因的PCR擴增結果見圖1。

2.3 不吸水鏈霉菌梧州新亞種膽固醇氧化酶基因片段的回收、純化結果

不吸水鏈霉菌梧州新亞種膽固醇氧化酶基因片段的回收、純化結果見圖2。

圖2 PCR瓊脂糖凝膠電泳擴增膽固醇氧化酶基因片段回收、純化結果Fig.2 Result of purification

2.4 陽性轉化子篩選及鑒定結果

陽性轉化子篩選及鑒定結果見圖3。

圖3 陽性轉化子酶切鑒定結果Fig.3 Result of macrorestriction of positive transformant

3 討論

利用濃度較高的基因組DNA作為模板進行PCR擴增;由PCR擴增后電泳檢測結果看出5、7號樣品條帶清晰，濃度較高，擴增條件適宜，所得到的擴增產物可以進行回收純化;由純化后電泳結果看出3個不同大小的條帶純化后純度很好，可以進行下一步試驗;由陽性轉化子篩選鑒定結果可以初步確定1號重組質粒為陽性轉化子，可以進行序列測定。

根據序列測定結果進行序列分析，基因全長為1 186 bp，去除載體序列序列長度為1 136 bp，NCBI中blast結果，此基因片段序列與Acidovorax avenae subsp.citrulli AA基因序列具有42.1%的同源性，與Syntrophobacter fumaroxidans MPOB，c基因序列具有44.1%的同源性，與天藍色鏈霉菌基因序列具有44.1%的同源性。根據文獻報道，鏈霉菌屬具有產生膽固醇氧化酶的能力，而此重組菌是否具有產生膽固醇氧化酶的能力還有待于進一步將序列中ORF進行分析［9］、PCR擴增，與表達載體如質粒PIJ702連接后轉入鏈霉菌中進行表達，并對膽固醇氧化酶活性進行測定后才能確定［10］。

［1］ 鐘學敏，孫艷，張玲，等.膽固醇氧化酶分離純化及應用的研究進展［J］.生物技術通報，2009，(4):44-49.

［2］ 劉衛德，蔣細良，冀穎，等.不吸水鏈霉菌ZBO1 cyp107z基因的克隆及原核表達純［J］.微生物學報，2011，51(3):410-416.

［3］ 趙紅巖，李莉，桓明輝，等.不吸水鏈霉菌梧州新亞種基因組文庫的構建［J］.微生物學雜志，2009，29(1):65-69.

［4］ 張璧，李莉，陳飛，等.不吸水鏈霉菌梧州新亞種限制修飾系統初探［J］.微生物學雜志，2008，28(2):65-68.

［5］ 張玲，霍惠芝，沈微，等.甾短桿菌膽固醇氧化酶基因在大腸埃希菌中的表達［J］.生物加工過程，2008，(1):21-26.

［6］ 侯思名，張薇，翟書華，等.云南藥用野生稻BIBAC文庫的構建及分析［J］.湖南農業大學學報(自然科學版)，2011，37(1):17-21.

［7］ 褚澄，薛利軍，趙忠新.腦特異性分子標志物vsnl1基因的克隆及原核表達［J］.揚州大學學報，2008，29(2):11-15.

［8］ 謝青軒，彭琦，劉春林，等.白菜型油菜BraSDG8基因的克隆與序列分析［J］.湖南農業大學學報(自然科學版)，2011，37(4):372-375.

［9］ Rica Dela Cruz，Yang Gao，Sahitya Penumetcha，et al.Expression of the Streptomyces coelicolor SoxR Regulon Is Intimately Linked with Actinorhodin Production［J］.Journal of Bacteriology，2010，192，(24):6428-6438.

［10］ 劉雪，范運梁，杜中亮，等.1株產膽固醇氧化酶的不動桿菌的篩選鑒定及特性研究［J］.生物技術，2010，20(3):80-83.