衛(wèi)星靈芝液體發(fā)酵富集硒鋅的研究

楊澤濤，李莉，陳超，修翠娟

(遼寧省微生物科學研究院，遼寧朝陽122000)

靈芝素有“仙草”、“瑞草”之稱，它因有滋補強壯、扶正固本、延年益壽等獨特功效而馳名中外。現代科學分析表明，靈芝的營養(yǎng)豐富且醫(yī)食價值高，它含有人體必須的氨基酸、脂肪酸、微量元素、胡蘿卜素及生物活性多糖等。藥食用真菌富含多糖，靈芝多糖具有多種生理功能，如抗衰老，防治癌癥等，能提高機體免疫力和耐氧能力，清除自由基，抑制腫瘤，抗輻射，提高肝臟、骨髓血液合成DNA、RNA和蛋白質的能力［1-4］。硒、鋅是人體必需的微量元素，硒是谷胱甘肽過氧化物酶的組成成分，具有保護細胞膜和血紅蛋白免受氧化的作用。研究證實人類的克山病、大骨節(jié)病、冠心病、糖尿病、癌癥等多種疾病都與缺硒有關。鋅是多種酶、蛋白質和核酸的重要組成部分，參與人體基因的復制、蛋白質的生物合成、激素與受體的特異結合，能促進生長發(fā)育與組織再生，提高動物體的生理和代謝功能及免疫作用。人體缺乏鋅會食欲不振、生長遲緩、免疫力下降、生殖機能受損等［5-9］。本文以靈芝為載體，采用深層發(fā)酵的方法生物富集硒、鋅，通過生物轉換作用將無機硒、鋅轉化為生物活性硒、鋅，提高靈芝的利用價值，為藥食用真菌富集微量元素的研究提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試菌種衛(wèi)星靈芝2號菌株，由遼寧省微生物科學研究院菌種中心提供，是1996年經我國“961020”返地式衛(wèi)星搭載后篩選出的太空誘變菌株。

1.1.2 原料玉米粉、黃豆粉、麩皮均為市售。

1.1.3 培養(yǎng)基①母種PDA綜合培養(yǎng)基(g/100 mL):去皮馬鈴薯20，葡萄糖2，KH2PO40.3，MgSO4·7H2O 0.15，酵母膏0.3，瓊脂2，維生素B11片/L，pH自然，蒸餾水配制;②液體種子培養(yǎng)基(g/100 mL):玉米面1.5，葡萄糖1，酵母膏0.3，KH2PO40.1，MgSO4·7H2O 0.05，維生素B11片/L，pH自然，蒸餾水配制;③發(fā)酵培養(yǎng)基(g/100 mL):玉米粉3，葡萄糖3，酵母膏0.3，KH2PO40.1，MgSO4·7H2O 0.05，維生素B11片/L，pH 6.0，蒸餾水配制。

1.1.4 化學試劑葡萄糖、蛋白胨、MgSO4、KH2PO4、維生素B1、酵母膏、Na2SeO3、ZnSO4。

1.1.5 主要儀器回旋式恒溫調速搖瓶柜，醫(yī)用電熱恒溫培養(yǎng)箱，電熱恒溫干燥箱，超凈工作臺，原子吸收分光光度計，AFS-830a雙道原子熒光光度計。

1.2 方法

1.2.1 分析方法①生物量測量方法:發(fā)酵液經4 000 r/min離心15 min后收集菌絲體，用蒸餾水沖洗2～3次，70℃烘干至恒重，稱重;②鋅、硒含量測定:采用火焰原子吸收分光光度計及AFS-830a雙道原子熒光光度計進行測定;③鋅、硒富集率的計算方法:鋅、硒富集率(%)=(菌絲體產率(%)×(菌絲體中鋅、硒含量mg/kg－分子量))/(1 000×10)×100。

1.2.2 菌種活化將衛(wèi)星靈芝斜面菌種接入PDA綜合培養(yǎng)基中，于27℃恒溫培養(yǎng)4～5 d，活化2～3代后備用。

1.2.3 菌種馴化以ZnSO4、Na2SeO3為供體，將活化后的衛(wèi)星靈芝菌株，用打孔器打取直徑為0.5 cm的菌塊，分別接種于含有不同濃度的硒或鋅的PDA培養(yǎng)基上，28℃恒溫培養(yǎng)5 d，測量其菌落直徑，對比不同添加濃度下的PDA平板上菌絲體生長情況。同時以未加硒或鋅元素的培養(yǎng)基做空白對照。

1.2.4 靈芝富集硒、鋅方法①單元素富集實驗:挑取馴化后發(fā)育良好的菌絲塊(直徑1.0 cm)于種子培養(yǎng)基中進行二次馴化培養(yǎng)。按規(guī)定10%(體積比)接種量分別接入含有不同濃度硒、鋅的液體發(fā)酵培養(yǎng)基中，180 r/min、29℃恒溫培養(yǎng)46 h，按照1.2.1方法測定菌絲體干重、菌絲體中硒、鋅的含量及轉化率，確定鋅。以未加鋅、硒的培養(yǎng)基做空白對照;②二元素同步富集實驗:同上操作，將馴化培養(yǎng)的種子培養(yǎng)液接種于同時含有一定濃度硒和鋅的發(fā)酵培養(yǎng)基中，按上述條件培養(yǎng)，測定菌絲體干重;稱取一定量的菌絲體粉，用透析法去除菌絲體中游離的硒和鋅，按照1.2.1方法測定透析前后的菌絲體中硒、鋅的含量，考察液體發(fā)酵同步富集2種元素有機化程度。

2 結果與分析

2.1 馴化試驗

2.1.1 不同亞硒酸鈉濃度對菌落形態(tài)影響分別以含亞硒酸鈉濃度為20、40、60、80、100、120、150、200、500 mg/L的PDA平板對試驗菌株進行馴化實驗。結果表明(表1):在試驗范圍內不同濃度的硒離子對平板上菌絲體的生長均具有不同程度的抑制作用，隨著濃度的增加抑制作用逐漸增強，致死濃度為500 mg/L。當培養(yǎng)基中亞硒酸鈉的濃度為80 mg/L時菌絲體長勢最好，菌絲體密集性強，馴化后的靈芝菌絲較對照短粗、形態(tài)濃密，菌絲潔白。

2.1.2 不同鋅濃度對菌落形態(tài)的影響分別以含硫酸鋅濃度為20、40、60、80、100、150、200、250、300、350、400、500 mg/L的PDA平板對衛(wèi)星靈芝菌株進行馴化實驗。結果表明(表2):實驗范圍內培養(yǎng)基中適宜濃度的鋅離子對靈芝菌絲的生長具有明顯促生長作用，靈芝菌落直徑隨鋅濃度的增加而增大，當鋅濃度達到150 mg/L時，菌落直徑達到最大，馴化效果也最好;馴化后的靈芝菌絲體較對照組潔白、粗壯、密集性強，菌絲較長。而后隨著鋅濃度的增加菌落直徑逐漸減小，促生長效果降低，鋅濃度大于300 mg/L時，對靈芝菌絲體生長具有明顯的抑制作用，鋅濃度500 mg/L時培養(yǎng)基凝固效果不好，靈芝菌絲體無法生長。

表1 不同濃度亞硒酸鈉馴化培養(yǎng)基中菌絲體的生長情況Table 1 Mycelial growth in taming medium with different sodium selenite concentration

表2 不同濃度硫酸鋅馴化培養(yǎng)基中菌絲體的生長情況Table 2 Mycelial growth in taming medium with different zinc sulfate concentration

2.2 亞硒酸鈉濃度對菌絲體生長和富集硒效果的影響

分別在液體發(fā)酵培養(yǎng)基中添加20、40、60、80、100 mg/L的亞硒酸鈉，接種馴化后的液體菌種進行搖瓶發(fā)酵。結果表明(表3):當發(fā)酵培養(yǎng)基中添加不同濃度的硒時，對菌絲體生長均具有不同程度的抑制作用，生物量明顯低于對照組，但靈芝菌絲體的富硒量隨著硒濃度的增加而提高，但當硒的濃度超過40 mg/L時，菌絲體生物量、富硒量最高，富集效果最好。

表3 硒濃度對靈芝菌絲體生長及富集的影響Table 3 Effect of selenium concentration on SGL mycelial growth and enrichment

2.3 鋅濃度對菌絲體生長和富集鋅效果的影響

分別在液體發(fā)酵培養(yǎng)基中添加20、40、60、80、100、150、200 mg/L的硫酸鋅，接種馴化后的液體菌種進行搖瓶發(fā)酵。由表4可以看出:當培養(yǎng)基中鋅濃度低于150 mg/L的范圍內對菌絲體生長有明顯的促進作用，生物量明顯高于對照組，而菌絲體中的鋅含量隨著鋅濃度的增加而增加，當培養(yǎng)基中的鋅濃度為60 mg/L，菌絲體中的鋅含量和富鋅轉化率最高。

表4 鋅濃度對靈芝菌絲體生長及富集的影響Table 4 Effect of zinc concentration on SGL mycelial growth and enrichment

2.4 液體培養(yǎng)同步富集鋅、硒實驗

在液體發(fā)酵培養(yǎng)基中添加40 mg/L的亞硒酸鈉和60 mg/L的硫酸鋅，接種馴化后的液體菌種進行搖瓶發(fā)酵，初步考察了靈芝液體發(fā)酵生產菌絲體中鋅、硒的含量及轉化率，同時采用透析的方法對菌絲體中鋅、硒的結合狀態(tài)進行了分析，見表5。初步的結果表明:當培養(yǎng)基中同時添加不同濃度的鋅和硒時，與單元素富集實驗相比，菌絲體中硒、鋅的含量及富集轉化率均較低;透析后靈芝菌絲體對鋅的富集效率與硒相比，富集效率較低，透析前后的菌絲體中硒的含量和富集率變化不大，說明靈芝菌絲體對無機硒的聚集主要是以有機硒的方式富集;而對無機鋅的富集結合狀態(tài)有無機和有機2種形式并存。

表5 液體深層發(fā)酵靈芝菌絲體同步富集鋅、硒的效應Table 5 Simultaneous enrichment effect of zinc and selenium in SGL mycelium in liquid submerged fermentation

3 討論

靈芝菌種經過無機鋅的馴化后，菌落形態(tài)明顯優(yōu)于對照組和無機硒實驗組，菌落邊緣整齊，菌絲長而粗壯、致密，色澤潔白，適當濃度范圍的無機鋅對靈芝菌絲體的促生長作用非常明顯，這主要緣于鋅與酶的關系極為密切，它決定并影響著160多種酶的活性，尤其對金屬酶具有催化性、結構性和調節(jié)性功能。這些酶類主要包括氧化還原酶(超氧化物歧化酶)、轉移酶(RNA聚合酶)、水解酶(堿性磷酸酶)、裂解酶(碳酸酐酶)及連接酶(tRNA合成酶)。鋅還是許多功能蛋白如金屬硫蛋白、核蛋白、受體等的組成成分，可直接參與核酸及蛋白質合成，對細胞的分裂生長及再生作用重大。而無機硒在靈芝所能忍耐的硒濃度范圍內，低濃度的硒對靈芝菌絲生長影響比較小，隨著硒濃度的增加抑制作用明顯增強，甚至引起毒害。

衛(wèi)星靈芝菌絲體具較強的富集硒、鋅的能力，液體深層發(fā)酵靈芝富硒菌絲體的最佳亞硒酸鈉濃度為40 mg/L，菌絲體生長量1.54%，富硒量2 131.5 mg/kg，富硒率32.91%。最佳硫酸鋅濃度為60 mg/L，菌絲體生長量1.76%，富鋅量為1 142.91 mg/kg，富鋅率為16.84%。培養(yǎng)基中同時添加40 mg/L亞硒酸鈉和60 mg/L硫酸鋅，透析前富硒量301.85 mg/kg，富硒率4.84%;富鋅量為540.41 mg/kg，富鋅率為5.72%;透析后富硒量295.86 mg/kg，富硒率4.75%;富鋅量為355.26 mg/kg，富鋅率為2.76%。

同步富集與單元素富集結果相比，靈芝菌絲體中的2種離子的含量及富集轉化率均較低，這是由于靈芝對鋅、硒的賦存形態(tài)主要是與靈芝蛋白組分相互結合，2種離子存在結合位點的競爭關系，所以富集結果明顯低于單元素富集效應。另外，在同步富集實驗中，衛(wèi)星靈芝富集硒元素的有機化程度較鋅元素高，透析前后的富硒率變化不大，這可能是由于2種離子在衛(wèi)星靈芝菌絲體中結合形式和參與代謝方式有關，如何提高同步富集硒、鋅的含量還有待于進一步的實驗研究。

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