胸水中肺腺癌細胞與血清中PTN多效蛋白分子生物學的研究

李長思，李明珠，楊利霞，王秀茹，杜明偉，李建華*

(1.中國醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院康復科，遼寧沈陽110001;2.中國醫(yī)科大學基礎醫(yī)學院暨附屬第一醫(yī)院病理科，遼寧沈陽110001;3.中國醫(yī)科大學基礎醫(yī)學院病理教研室，遼寧沈陽110001)

PTN(pleiotrophin)最早是1989年在華盛頓大學醫(yī)學中心純化的一種生長因子［1］，當時認為該因子為17 ku的蛋白，與肝素具有高親和性，并首次被命名為HBGF-8(heparin Binding growth factor-8)。1990年華盛頓大學醫(yī)學中心的進一步研究［2］發(fā)現(xiàn)，該因子與當時已知的7個與肝素結合的生長因子不存在明顯同源性，并因該蛋白具有多種生物學活性而改名為pleiotrophin(PTN)，意為多效蛋白，從而更能準確地表達該因子的特性。PTN編碼168個氨基酸，與MK存在50%的序列同源性，兩者共同組成肝素結合超家族。PTN在多種腫瘤組織及血清中高表達［3-5］，具有促進有絲分裂及血管新生的特性，影響腫瘤細胞的血供、生長及轉(zhuǎn)移。研究表明，PTN蛋白在肺癌組織中含量豐富，早期即可在血漿中出現(xiàn)，并且與腫瘤的分期相關［6］，2002年Jajer等用ELASA法檢測肺癌患者血清中的PTN表達水平，發(fā)現(xiàn)PTN濃度比正常血清中的濃度顯著增高，并且與臨床病理分期成正相關，與化療藥物成負相關。本研究的目的是檢測PTN在肺腺癌不同標本中的表達，并分析它們之間的關系，探討PTN在肺腺癌EMT轉(zhuǎn)化中的作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 臨床資料收集2008年至2010年間肺腺癌患者的術前血清83例和相對應的肺腺癌所致的惡性胸水。另收取50例正常獻血者血清、50例良性胸水增生細胞(炎癥、結核、創(chuàng)傷所致)作為對照。所有標本均取自中國醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院病理科。

1.1.2 試劑鼠抗人PTN(H-6)(sc-74443)單克隆抗體(濃縮性)購自美國Snata公司，辣根過氧化物酶標記的羊抗鼠二抗于4℃保存待用。兔抗人TTF1單克隆抗體(即用型)、鼠抗人CK19單克隆抗體(即用型)、鼠抗人E-ca單克隆抗體、兔抗人vimentin單克隆抗體(即用型)、S-P超敏免疫組化試劑盒和DAB酶底物顯色試劑盒均購自北京中杉生物技術有限公司。

1.2 方法

1.2.1 免疫細胞化學技術胸水標本常規(guī)離心、沉淀包埋、切片、脫蠟、水化，按S-P法常規(guī)步驟進行，以PBS代替一抗作陰性對照。結果判定標準:每張切片在光鏡下隨機選取5個視野，每個視野計數(shù)100個瘤細胞。著色強度:無色為0分，淺黃色或黃色為1分，棕黃色為2分。陽性細胞數(shù)＜10%為0分，10%～50%為1分，＞50%為2分，2項得分相乘結果＞2記為陽性(+)，＜2為陰性。

1.2.2 Western-blot技術總蛋白從血清和胸水細胞中提取，冰上超生處理，4℃靜置，孵育50 min，4℃離心20 min(1 000 r/min)，提取上清，用Brodford法測定蛋白濃度，以每孔80 μg蛋白加入10%SDS-PAGE凝膠電泳后，4℃，50 V條件下濕電轉(zhuǎn)移儀將蛋白轉(zhuǎn)入0.22 μm PVDF膜，5%脫脂奶粉封閉液封閉2 h，在分子量為18～25 ku附近剪開PVDF膜孵育一抗(PTN 1∶100稀釋)4℃過夜，X底片曝光，顯影，定影后拍照，以β-actin為內(nèi)參，用凝膠成像及分析系統(tǒng)(BioImaging Systems，美國)分析蛋白各條帶的灰度值，并取其與β-actin的比值為相對表達量分析PTN的表達情況，每組結果均為相同體條件重復3次。

1.2.3 統(tǒng)計學分析應用SPSS13.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)處理，采用χ2檢驗(不滿條件時用Fisher確切概率法)分析各組計數(shù)資料，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果與分析

2.1 血清中PTN蛋白Western-blot結果顯示

如圖1所示，在肺腺癌患者的血清中可見有特異性條帶，其中Ⅳ期肺腺癌患者的血清PTN蛋白表達水平明顯高于Ⅰ期肺腺癌患者的血清PTN蛋白表達水平。

2.2 PTN蛋白在胸水細胞中的免疫組化結果顯示

在本研究中，首先做了免疫細胞化學CK19、TTF1染色，在所收集的189例惡性胸水細胞中兩者均呈強陽性表達，由此推斷所收集的惡性胸水細胞標本均為肺腺癌轉(zhuǎn)移至胸水所致的惡性胸水細胞，如圖2所示。PTN蛋白在惡性胸水腺癌細胞的陽性率為59%(49/83)，在胸水良性增生細胞中的陽性率為0%(0/50)，PTN蛋白在惡性胸水細胞中的陽性率高于胸水良性增生細胞中的陽性率(P＜0.01)。

圖1 血清中PTN蛋白Western-blot結果顯示Fig.1 PTN protein Western-blot analysis showed in serum

圖2 PTN蛋白在胸水細胞中的免疫組化結果顯示(400×)Fig.2 PTN protein in pleural effusion cells in immunohistochemical results show(400×)

2.3 PTN蛋白的表達和EMT之間的關系

PTN蛋白在肺腺癌患者的2種不同標本中陽性率的比較如表1所示，PTN蛋白在轉(zhuǎn)移至胸水細胞中的陽性率59%(49/83)高于血清中的陽性率32.5%(27/83)，差異具統(tǒng)計學意義(P＜0.05)，提示PTN的表達在肺腺癌的EMT轉(zhuǎn)變中有非常重要的作用。83例肺腺癌轉(zhuǎn)移至胸水細胞中的PTN和Vimentin表達之間的關系如表2所示，PTN和Vimentin成正相關，差異具統(tǒng)計學意義(P＜0.01，r=0.728)。

表1 PTN蛋白在2種不同標本中陽性率的比較Table 1 The comparision of PTN protein positive rates in three difference specimens

表2 在惡性胸水腺癌細胞中PTN和Vimentin表達之間的關系Table 2 The relationship between PTN and Vimentin expressions in lung adenocarcinoma cells from pleural fluid

3 討論

肺癌對人類健康的危害日益嚴重，由于難以早期發(fā)現(xiàn)和易于轉(zhuǎn)移，導致肺癌死亡率增高，患者手術后5 a存活率降低。因此，近年來許多學者把研究的焦點聚集在肺癌的早期診斷和EMT(上皮間質(zhì)化)上。

癌癥的發(fā)生過程是一系列分子事件的作用引發(fā)的，包括基因突變(例如ras和p53基因突變)、生長因子和受體的過度表達、突變后的細胞能夠惡性增長和易發(fā)生轉(zhuǎn)移，并對藥物產(chǎn)生抵抗，激活的PTN可能通過某種信號轉(zhuǎn)導途徑使腫瘤細胞更惡性增長，因為發(fā)現(xiàn)在多種腫瘤組織中，PTN是高表達的，如神經(jīng)細胞瘤、神經(jīng)膠質(zhì)瘤、卵巢癌、前列腺癌、wilms瘤、絨癌和黑色素瘤等［7］，在這些腫瘤組織中內(nèi)源性的PTN基因持續(xù)活化，而在相應的正常組織中很難檢測到PTN的表達。在神經(jīng)母細胞瘤中PTN和它的受體RPTPβ/ζ都表達增加［8］，并且它們的表達水平與該腫瘤惡性程度有關。PTN在某些腫瘤組織中，表現(xiàn)出細胞轉(zhuǎn)化、抗凋亡、血管生成和纖溶等與腫瘤侵襲性生長有關的特性［9］。

1998年Souttou等［10］用ELISA方法檢測消化道腫瘤患者血清中的PTN表達，發(fā)現(xiàn)腫瘤患者血清中的PTN表達水平顯著高于正常對照，并與腫瘤的分期，腫瘤負荷相關。隨后用免疫組織化學方法檢測相應腫瘤患者組織中的PTN表達水平，結果發(fā)現(xiàn)，血清中PTN高表達的腫瘤患者，其組織中PTN亦高表達，并且術后患者血清中的PTN濃度較術前大大降低。2002年Jajer等［11］也用ELISA方法檢測肺癌患者血清中的PTN表達水平，發(fā)現(xiàn)肺癌患者血清中的PTN表達水平明顯高于對照組，并與腫瘤的分期成正相關，與化療藥的療效成負相關，推測檢測血清中的PTN表達水平可能成為早期診斷肺癌的一種有效方法。Jager等［12］在1997年應用RT-PCR檢測了26株肺癌細胞系中的PTN mRNA表達，其中有12株小細胞肺癌(SCLC)，14株非小細胞肺癌(NSCLC)，結果顯示9株SCLC和3株NSCLC有PTN mRNA的表達。

細胞發(fā)生上皮間質(zhì)化(EMT)時，EMT表現(xiàn)為上皮細胞失去極性，與周圍細胞和基質(zhì)的接觸減少，細胞黏附力下降，遷移和運動能力增加，同時細胞表型發(fā)生改變，而在腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移過程中細胞首先獲得EMT的特性，以實現(xiàn)對周圍組織的浸潤和遠處器官的轉(zhuǎn)移，一旦這一過程完成，這些細胞就可能通過間質(zhì)細胞上皮轉(zhuǎn)型(mesenchyma-ep ithelial transition，MET)而重新獲得增殖能力［13-14］，Mitsiadis等［15］在1995年研究發(fā)現(xiàn)在胚胎發(fā)育(胚胎形成的9～14.5 d)和器官形成過程中，PTN在上皮間質(zhì)化過程中發(fā)揮作用，如在神經(jīng)系統(tǒng)、感覺器官、呼吸器官、消化器官、泌尿生殖器官以及骨骼和牙齒的發(fā)育過程中這2種蛋白都可以被檢測出來。那么PTN在腫瘤EMT形成過程中是否也發(fā)揮重要的作用呢，2006年Perez-Pinera等［16］研究發(fā)現(xiàn)PTN可以破壞鈣依賴的細胞與細胞之間的黏附從而引起EMT，但這是作者在體外PTN處理細胞獲得的結論，然而在體內(nèi)肺腺癌細胞中是否有PTN蛋白的存在，以及在肺腺癌EMT轉(zhuǎn)變過程中其作用是什么。

本研究發(fā)現(xiàn)PTN在肺腺癌患者的2種不同標本中均高表達，同時直接比較早期肺腺癌(未發(fā)生轉(zhuǎn)移的肺腺癌血清)和中晚期肺腺癌(發(fā)生轉(zhuǎn)移的胸水)中PTN蛋白的表達，發(fā)現(xiàn)在中晚期肺腺癌中較早期肺腺癌中PTN蛋白的表達率高，說明PTN蛋白的表達在肺腺癌的侵襲轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮了重要的作用。

以上研究表明PTN在肺腺癌中高表達，并且在其發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移過程中也起重要的作用，尤其在肺腺癌的EMT轉(zhuǎn)變中，其作用越來越受到人們的重視。未來的研究可以PTN作為藥物靶點，或者對其信號通路進行干預，或者體外合成PTN抑制劑，達到下調(diào)PTN的作用［17］，從而阻止EMT過程的發(fā)生。

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