采用熔點曲線法研究乙肝病毒準種與拉米夫定臨床耐藥相關性

溫志立，王艷華，張華，張海明，譚德明，李慶安，吳平，鄧樂

(1.南昌市第九醫院，江西南昌330008;2.南昌大學第三附屬醫院感染科，江西南昌330008;3.南昌市衛生學校，江西南昌330008;4.中南大學湘雅醫院感染科，湖南長沙410008;5.中國人民解放軍第163醫院感染科，湖南長沙410008)

據世界衛生組織(WHO)報道，全球約20億人曾感染過乙肝病毒(hepatitis B virus，HBV)，其中3.5億人為慢性感染者，每年約有100萬人死于HBV感染所致的肝衰竭、肝硬化和原發性肝細胞癌［1］。近年來，由于拉米夫定等核苷類抗病毒藥物的不斷應用，一度給慢性乙型肝炎(chronic hepatitis B，CHB)的治療帶來曙光，但是由于在抗病毒治療過程中不斷出現的病毒耐藥、停藥后反彈等問題，給臨床醫師及患者帶來許多困惑。2005年《慢性乙型肝炎防治指南》提出了HBV準種的概念，即將HBV感染者體內形成以一個優勢株為主的相關突變株病毒群稱為HBV準種［2］。國內外已有研究表明，HBV感染的慢性化、疾病轉歸及藥物治療耐受等都可能與HBV準種密切相關［3］，例如拉米夫定等核苷類似物耐藥的產生就與HBV P基因準種的變異有關，而且HBV P基因變異是多位點的，以YMDD基因的變異最為重要。因此，通過監測HBV P基因準種的變化有助于預測HBV對拉米夫定等核苷類似物的耐藥。熔點曲線是通過動態檢測雙鏈DNA分子的熔點溫度(Tm)進行單核苷多態性分析的一種分子生物學方法。當同一樣本中存在不同的基因變異(或稱準種)時，由于G/C含量變化導致Tm值可能改變，便可出現與準種數量相對應的幾個波峰，該法操作簡便，用于病毒準種檢測準確可靠，之前已用熔點曲線分析了HBV準種和臨床病情的相關性［4］，取得了較好結果。為此，準備在之前基礎上，采用熔點曲線技術從準種的角度來探索HBV對拉米夫定耐藥機制，從而為臨床抗病毒治療提供指導。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 研究對象采用查隨機數字表方法，從2008年3月至2009年11月期間在南昌大學第三附屬醫院感染科住院及門診就診的CHB患者中，隨機選擇30例接受拉米夫定抗病毒治療后發生YMDD病毒變異的患者和30例停用拉米夫定后發生病毒學反彈的患者作為研究對象，同時隨機選擇30例沒有接受拉米夫定抗病毒治療的患者作為對照。在這90例病人中有男性73例，女性17例，年齡22～65歲，平均年齡(38.1±12.5)歲。為避免患者病情輕重不一給實驗帶來的干擾，所有病例均為CHB中度病例，均按照2010年全國肝炎會議最新修訂的《慢性乙肝防治指南》［5］標準選擇，而且血清HBsAg陽性至少6個月，剔除重疊HIV、HCV或HDV感染、自身抗體陽性、失代償期肝病、甲亢患者、精神病患者及妊娠婦女，近6個月無抗病治療史，甲狀腺功能正常。病毒變異組和病毒反彈組患者均口服拉米夫定(葛蘭素史克制藥有限公司)抗病毒治療，每次100 mg，每日1次，療程均在1 a以上。所有患者均理解研究內容并簽署知情同意書。收集所有90例患者的血清標本，保存于－70℃。

1.1.2 主要試劑DNA抽提試劑盒由上海達安基因公司提供;dNTPs(10 mmol/L，北京全式金公司);Taq DNA Polymerase(5 U/μL，美國NBI公司產品);Mg2+(10 mmol/L，美國NBI公司產品);10×Buffer緩沖液購自Fermantas公司;2%SYBR Green I熒光染料(美國Molecular proble公司提供);1 mmol/L的純熒光素校準染料(Fluorescein Calibration Dye，美國BIO-RAD公司產品);用純熒光素校準染料稀釋緩沖液將其稀釋1 000倍，配成1 μmol/L的稀釋液。

1.1.3 引物參照溫志立等［4，6］文獻設計引物，其中引物P1、P2擴增P基因長片段(1 058 bp)，引物C1、C2擴增C基因長片段(639 bp)，引物S1、S2擴增S基因長片段(1 178 bp)，均由上海生物工程科技公司合成(表1)。

表1 擴增HBV P基因、C基因和S基因的引物序列Table 1 Primer sequences for amplifying HBV P gene，C gene and S gene

1.1.4 主要儀器實時熒光PCR儀器(7300，美國ABI公司);金屬干浴器(K30，深圳威斯比生物科技發展公司);低速臺式離心機(TD5A-WS，長沙湘儀離心機儀器有限公司);超凈化工作臺(SW-CJ-IF型，蘇州凈化設備廠);－20℃冰箱(日本三洋公司);－70℃超低溫冰箱(MDF-u208bs，日本三洋公司)。

1.2 方法

1.2.1 HBV-DNA提取取1.5 mL PCR管加入50 μL DNA提取液，再加入待測血清50 μL，震蕩后混勻，置入金屬干浴器，100℃10 min后取出，放置，待冷卻至室溫后置入離心機中，12 000 r/min離心10 min，取上清2 μL做為PCR反應模板。

1.2.2 熒光實時PCR及熔點曲線分析參照文獻［7］進行。取0.2 mL PCR管，按下列體系加入:P1/C1/S1(50 pmol/L)0.5 μL，P2/C2/S2(50 pmol/L)0.5 μL，dNTPs(10 mmol/L)0.5 μL，Pulas Taq 0.5 U，Mg2+(25 mmol/L)2.0 μL，10×Buffer 2.5 μL，DNA模板0.5 μL，2%SYBR Green I 0.5 μL，自制熒光染料緩沖液0.5 μL，加DDW定容至25 μL。置入ABI7300實時熒光PCR儀中，按下列條件進行擴增:95℃預變性5 min，94℃60 s，58℃60 s，72℃60 s，共35個循環，最后72℃延伸7 min。擴增結束后按ABI7300PCR反應儀設定的條件進行熔點曲線分析，55℃開始收集熒光信號，直到95℃后結束。

1.2.3 統計學處理全部數據應用SPSS 13.0統計軟件包處理，數據用ˉχ±S表示，組間比較采用配對t檢驗，P＜0.05表示有統計學意義。

2 結果與分析

拉米夫定治療后病毒變異組患者體內HBV P區準種數量為2.50±0.86個，病毒反彈組為5.30±0.95個，未治療組為8.37±0.93個。3組準種數量兩兩比較，P均小于0.05，有統計學意義。HBV C區病毒變異組準種數量為6.10±1.86個，病毒反彈組為6.37±1.81個，未治療組為6.33±1.64個。3組準種數量兩兩比較，P均大于0.05，無統計學意義。HBV S區病毒變異組準種數量為5.23±1.85個，病毒反彈組為6.17±1.93個，未治療組為5.77±2.11個。3組準種數量兩兩比較，P均大于0.05，無統計學意義(表2)。

表2 不同組別熔點曲線波峰數量比較(±S)Table 2 comparison of wave peak amounts among different groups

表2 不同組別熔點曲線波峰數量比較(±S)Table 2 comparison of wave peak amounts among different groups

組別例數P區C區S區302.50±0.866.10±1.865.23±1.85病毒反彈組305.30±0.956.37±1.816.17±1.93未治療組308.37±0.936.33±1.645.77±2.11 P P＜0.05P＞0.05P＞0.05病毒變異組

從3組患者的HBV P區熔點曲線圖(圖1～3)中還可以清晰地看到，病毒變異組優勢病毒群的熔點與病毒反彈組和未治療組相比，已發生明顯的偏移，病毒反彈組和未治療組優勢病毒群的熔點均在75～80℃之間，而病毒變異組優勢病毒群的熔點卻在75℃以下。在3組患者的HBV C區和S區熔點曲線圖中，3組的波峰數和優勢病毒群的熔點均沒有明顯變化。

圖1 病毒變異組HBV P區熔點曲線圖Fig.1 Melt curve plot of HBV P gene in virus variation group

圖2 病毒反彈組HBV P區熔點曲線圖Fig.2 Melt curve plot of HBV P gene in virus rebound group

圖3 未治療組HBV P區熔點曲線圖Fig.3 Melt curve plot of HBV P gene in non-treatment group

3 討論

準種現象普遍存在于RNA病毒中，HBV雖屬DNA病毒科，但同樣存在準種現象，而且準種是乙型肝炎病毒存在的基本方式，其各編碼區均存在準種。近年來研究發現，HBV準種與核苷類似物的耐藥密切相關。2000年Richman［8］認為，HBV對某一抗病毒藥物表現耐受其實是一個逐漸發展的過程。在未接受過核苷類藥物治療的患者中，HBV野生株占HBV準種的絕大多數，但耐藥變異株在患者用藥前就可能存在，也有可能在用藥過程中產生。患者用藥后，對藥物敏感的病毒野生株受到抑制，含有耐藥突變的準株得以有更多空間進行復制。當對某一藥物有耐藥性的病毒株成為準種中的優勢病毒株時，藥物就失去療效。耐藥株的復制能力和適應能力雖然較野生株弱，但在藥物選擇壓力持續存在的情況下，產生許多代償性突變株，使其復制能力增強，輔助耐藥株成為準種的優勢株［9］。由此可知HBV耐藥株的產生過程其實就是耐藥株從逆勢種群向優勢種群變遷的過程。

乙肝病毒準種可采用不同的方法來進行鑒定和分析，如聚合酶鏈反應-限制性內切酶切片段長度多態性分析(Polymerase Chain Reaction-Restriction Fragment Length Polymorphism，PCR-RFLP)法［10］、單鏈構象多態性(Single-Strand Conformation Polymorphism，SSCP)法［11］等。PCR-RFLP法對于限制性酶切點發生突變的檢測十分有效，但對某些靶序列并不適合。SSCP是目前準種分析的主要手段之一，具有快速、簡便、靈敏等特點，其原理基于點突變引起單鏈DNA分子立體構象的改變，通過電泳分離可鑒別，它可以檢測各種點突變、短核苷酸序列的缺失或插入，但其工作量大，操作步驟煩瑣，電泳條件要求較嚴格，而且當某些位置的點突變對單鏈DNA分子立體構象的改變不起作用或作用很小時，電泳就無法分辨。同SSCP相比，熔點曲線法是一種比較簡便、實用的檢測準種的方法，是通過動態檢測雙鏈DNA分子的熔點溫度(Tm)進行單核苷多態性分析的一種分子生物學方法，其主要原理在于SYBR Green I是不對稱腈類熒光素，一般不與單鏈DNA結合，但能非特異嵌合于DNA雙螺旋結構中的小溝內，結合狀態的熒光強度較之游離狀態的熒光增加數千［7］。因此，只需要在擴增體系中直接加入SYBR Green I即可實時PCR定量及基因變異分析。當同一樣本中存在不同的基因變異(或準種)時，由于G/C含量變化導致Tm值改變，便可出現與準種數量相對應的幾個波峰。國外學者已經研究證實，溶點曲線方法操作簡便，準確可靠，很好解決了其他準種鑒定方法所遇到的問題［12］。

本實驗采用熔點曲線法分析了3種CHB患者體內HBV準種情況，包括HBV基因突變導致耐藥患者、停藥后發生病毒反彈患者和未經拉米夫定治療患者，結果發現3組HBV P區準種數量有顯著性差異(P＜0.05)，從小到大依次為病毒變異組、病毒反彈組和未治療組，而且病毒變異組優勢病毒群的熔點與病毒反彈組、未治療組相比，已發生明顯的偏移，這說明在拉米夫定壓力下，HBV發生變異，不僅P區的準種數量明顯減少，而且準種的性質也發生了明顯的變化，這可能是由于一些耐藥的劣勢準種隨著優勢準種逐漸被殺滅，趁勢大量繁殖而成為優勢準種所致。黃燕萍等［11］應用SSCP/異源雙鏈分析法研究了拉米夫定與HBV準種及變異特點的關系，發現拉米夫定治療前HBV P區準種數量為7～14(平均9.8)，高于治療后準種數量4～8(平均5.7)，并認為在拉米夫定藥物篩選下HBV準種改變，同時出現YMDD序列變異，與本研究結果相似。Ohishi［13］用PCR-肽核酸鉗法檢測了CHB患者使用拉米夫定治療前后的HBV準株，發現治療前患者體內HBV準株數高于治療后，但治療后的優勢準株數卻高于治療前。在長期使用拉米夫定過程中，當耐藥突變株成為準種的優勢株時，不僅可引起耐藥，同時還可增加不良事件的發生概率。Lok［14］通過回顧性分析一項拉米夫定耐藥安全性3期臨床實驗的數據后發現，相比于沒有拉米夫定耐藥的患者，耐藥者有更高的肝炎復發比率。另外，經過對S區、C區準種進行分析，結果顯示3組病人的HBV C區和S區準種數量均無顯著性差異(P＞0.05)，優勢準種的熔點也無明顯變化，這說明拉米夫定對HBV S區、C區基本上沒有作用，與國內外關于拉米夫定耐藥位點的報道相符。

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