內生放線菌對鬼臼毒素的微生物轉化

曹松，曾志剛

(中國醫藥集團四川抗菌素工業研究所，四川成都610052)

鬼臼毒素(Podophyllotoxin)(圖1)又名鬼臼素、鬼臼毒，是一種具抗腫瘤活性的先導化合物，屬于木脂素類，主要從鬼臼類植物(桃兒七、八角蓮、山荷葉)中分離得到［1-2］。鬼臼毒素通過破壞有絲分裂細胞中的微管蛋白集結及微管的形成，使細胞有絲分裂停止在M期，抑制腫瘤細胞分裂，發揮抗腫瘤作用［3-4］。瑞士Sandoz公司首先合成了鬼臼毒素的C-4位糖苷化衍生物依托泊苷(Etoposide)和替尼泊苷(Teniposide)，用于治療肺癌、淋巴癌、白血病、睪丸癌等［5-6］。但鬼臼毒素具有強烈的毒副作用，如:導致貧血、脫發、胃腸道功能紊亂、骨髓抑制等，限制了其臨床使用［7］，因此其分子結構有進一步修飾的必要。

圖1 鬼臼毒素Fig.1 Podophyllotoxin

為獲得結構新穎的鬼臼毒素類活性物質，探索它們的構效關系，一條途徑是用化學合成方法改造其結構，另一條途徑是微生物轉化。微生物轉化具有區域和立體選擇性強、反應條件溫和、操作簡單、成本低廉等優點，還能完成一些化學方法難以實現的反應，常被用于天然產物的化學修飾，以獲得一些結構更合理或活性更好的類似物或衍生物［8-12］。國內外學者對鬼臼毒素的微生物轉化作了一些探索，北京大學果德安教授［13-14］利用青霉菌和掌葉大黃細胞轉化鬼臼毒素，使鬼臼毒素D環的反式結構轉化為順式，得到無活性的鬼臼苦素。英國諾丁漢大學Broomhead等［15］發現美國金鐘連翹懸浮培養細胞具有將鬼臼毒素氧化為鬼臼毒酮的能力。澳大利亞墨爾本大學Teng等［16］利用大麥懸浮培養細胞轉化鬼臼毒素，得到異鬼臼苦酮。本研究從桃兒七根莖中分離出能轉化鬼臼毒素的內生放線菌，用其轉化鬼臼毒素，獲得了1種轉化產物，經結構分析初步確定為4'-去甲基表鬼臼毒素，菌種鑒定為Streptomyces sp.，為進一步研究內生菌與鬼臼毒素的微生物轉化的機理和開發利用鬼臼毒素類活性物質奠定了基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品采集2010年4月中旬，于成都植物園采集桃兒七根莖樣品，樣品經1 d左右自然風干后進行內生放線菌的分離。

1.1.2 培養基分離培養基(ISP2):酵母粉4 g，麥芽提取物10 g，葡萄糖4 g，瓊脂15 g，蒸餾水1 L，pH 7.3，121℃滅菌20 min;種子培養基/轉化培養基:葡萄糖10 g，蛋白胨5 g，酵母粉5 g，玉米漿5 g，牛肉膏3 g，FeCl30.05 g，KH2PO40.5 g，NaCl 0.5 g，MgSO40.5 g，蒸餾水1 L，pH 7.0，121℃滅菌20 min。

1.1.3 試劑鬼臼毒素購自西安楊森制藥有限公司，純度98%;PCR試劑購自北京天根生化科技有限公司;PCR回收試劑盒、合成引物購自上海生工生物工程技術服務有限公司;序列測定于英俊生物科技有限公司。

1.1.4 儀器島津LC-20A高效液相色譜儀;Varian Mercury-300BB型核磁共振儀;Agilent MSD Trap離子阱質譜儀。

1.2 方法

1.2.1 桃兒七根莖內生放線菌的分離材料預處理采用75%乙醇擦拭表面及切口，并于火焰上快速烤干，風干保存1 d左右后處理進行內生放線菌的分離，如近期不分離的材料則置于4℃保存。表面消毒采用Coombs等［17］方法，使用無菌刀將消毒后的莖部組織切成1 cm2左右的小片，貼在分離培養基表面，留下最后一遍無菌水清洗液做涂布對照，用來檢測表面消毒效果。接種后于28℃培養間培養3～5周。約3～4周后，大多數內生放線菌長出，無菌操作條件下用接種針挑取放線菌到ISP2平板劃線，純化后的菌株轉接到ISP2斜面活化培養。

1.2.2 鬼臼毒素轉化菌株的篩選將分離的內生放線菌接種至裝有50 mL種子培養基的搖瓶(250 mL)中，28℃振蕩培養3 d，然后以10%的接種量接入轉化培養基中，發酵3 d，然后在搖瓶中加入用乙醇溶解的鬼臼毒素30 mg，繼續培養。每間隔1 d取10 mL包含菌絲體的發酵液，用勻漿器搗碎，利用等量的乙酸乙酯萃取，通過旋轉蒸發濃縮萃取液，用TLC和高效液相色譜(HPLC)對樣品進行檢測，篩選能對鬼臼毒素進行生物轉化的內生菌株。TLC條件:展開劑為氯仿-丙酮(5∶1)，254 nm紫外顯色;HPLC條件:色譜柱為C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)，流動相乙腈∶水=40∶60，流速1.0 mL/min，紫外檢測波長230 nm。

1.2.3 生物轉化產物的分離和結構鑒定按上述方法對篩選獲得的內生放線菌發酵，收集10 L發酵液，離心分離菌絲體并用勻漿器搗碎，而后與上清液合并，用乙酸乙酯萃取3次，合并萃取液，旋轉蒸發濃縮，濃縮部分(5.2 g)經過硅膠柱層析(流動相氯仿-丙酮梯度洗脫)分離，獲得相關組分A(50 mg)，然后用制備HPLC(流動相乙腈∶水=50∶50)純化，得到轉化產物A(15 mg)，然后對其做質譜和核磁進行結構鑒定。

1.2.4 內生放線菌的鑒定①菌絲形態觀察:通過掃描電鏡觀察菌絲的形態，在ISP2平板上挖1 cm寬的長方形小穴，在穴的邊緣接種，然后蓋上無菌蓋玻片，培養10～14 d，取出蓋玻片噴金，進行掃描電鏡觀察;②菌落培養特征:選取9種培養基，在28℃培養菌株，觀察并記錄第4、7和14天菌落形態以及色素的有無和顏色等。9種培養基包括ISP2培養基、ISP3培養基、ISP4培養基、LB培養基、蔗糖察氏培養基、TSB培養基、葡萄糖酵母瓊脂培養基、PDA培養基、高氏一號培養基;③生理生化特性:實驗方法參照文獻［18］進行，對菌株的生長條件(溫度、pH)、NaCl耐受性、C源利用、N源利用、酯酶分解、淀粉水解、明膠液化、牛奶凝固及凍化、纖維素分解、硝酸鹽還原、MR實驗、色氨酸分解、H2S產生、氧化酶和過氧化氫酶產生等生理生化指標進行了考察;④16S rRNA基因的PCR擴增及測序:采用酶解法提取菌絲體的DNA，選用通用引物PA8:5'-CCGTCGACGAGCT CAGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'，PB1:5'-CCCGGGTACCAAGCTTAAGGAGGTGATCCAGCCGCA-3'，擴增16S rRNA基因序列。利用上海生工生物工程公司SanPrep DNA膠回收試劑盒對擴增產物進行回收，然后送樣、測序;⑤系統發育分析:將菌株的16S rRNA基因序列在NCBI上BLAST比對，再用Eztaxon數據庫對序列進行在線分析［19］，把相近模式菌種的序列放在一起做比對，序列比對采用Bioedit和Clustal X軟件，然后用Mega 4.0軟件構建NJ系統發育樹［20］。并將測得序列提交GenBank注冊，獲得登錄號。

2 結果與分析

2.1 內生放線菌的分離及轉化鬼臼毒素菌株的篩選

圖2 鬼臼毒素標準品HPLC圖譜Fig.2 HPLC chromatograms of podophyllotoxin standards

圖3 CS-1轉化鬼臼毒素HPLC圖譜Fig.3 HPLC chromatograms of podophyllotoxin biotransformed by CS-1

利用純培養法從桃兒七根莖分離獲得20株內生放線菌，編號為CS-1～CS-20。將20株內生放線菌接種于轉化培養基中培養至對數生長期，加入鬼臼毒素繼續培養，然后對發酵液進行TCL和HPLC分析，篩選能轉化鬼臼毒素的內生放線菌。經過幾輪篩選發現，內生放線菌CS-1能轉化鬼臼毒素生成產物1。圖2是鬼臼毒素標準品的HPLC圖譜，圖3是CS-1菌株發酵液的HPLC圖譜，其中峰1是新出現的峰，為鬼臼毒素轉化產物的吸收峰，峰2是鬼臼毒素的吸收峰，峰3是培養基的吸收峰。HPLC檢測條件:色譜柱為C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)，流動相乙腈∶水=40∶60，流速1.0 mL/min，紫外檢測波長230 nm。

2.2 生物轉化產物1的結構鑒定

生物轉化產物1(15 mg)為白色粉末。ESIMS中m/z 399處出現［M-H］－的分子離子峰，表明產物1的相對分子質量為400，比底物鬼臼毒素小了14，恰好為1個亞甲基。其1H NMR(DMSO)數據與4'-去甲基表鬼臼毒素的文獻值一致(表1)［21］，可以推斷它是4'-去甲基表鬼臼毒。

表1 轉化產物11H NMR(DMSO)的化學位移(×10－6)Table 1 1H NMR data of transformation product 1(δ values in×10－6)

2.3 鬼臼毒素轉化內生放線菌鑒定

2.3.1 形態特征菌株CS-1在ISP2培養基中產生基內菌絲和氣生菌絲，菌絲無橫隔，不斷裂(圖4)。菌落表面呈皺褶狀，顏色呈灰白色;基內菌絲呈黃褐色，不產生可溶性色素。

圖4 CS-1在ISP2培養基上11 d的掃描電鏡照片Fig.4 SEM photograph of strain CS-1 on ISP2 medium for 11days

2.3.2 培養特征菌株CS-1在基礎培養基中不長，在蔗糖察氏瓊脂培養基中生長較差，ISP3、LB、TSB、ISP4等培養基中生長中等，在其他培養基中生長良好，在這9種培養基中都不產生可溶性色素，菌落形態、基內菌絲顏色變化較大，見表2。

表2 CS-1在不同培養基上的特征Table 2 Characteristics of CS-1 on different medium

2.3.3 生理生化特征菌株CS-1在20～40℃、pH 6～12條件下可以生長，能耐受10%NaCl，該菌能利用D-阿拉伯糖、D-果糖、D-甘露醇、肌醇、鼠李糖、甘油、膠醛糖、α-半乳糖、D-木糖，不能利用山梨醇、葡糖糖、山梨糖作為碳源;能較好地利用L-纈氨酸、L-谷氨酸、L-酪氨酸，微利用L-組氨酸，不利用L-色氨酸、L-賴氨酸、尿素、甘氨酸。菌株CS-1不能水解淀粉，可使明膠液化，牛奶凝固且凍化，能水解Tween 80、不能分解纖維素;不能使甲基紅變紅，不產生硫化氫，無法還原硝酸鹽，能產生色氨酸酶、氧化酶以及過氧化氫酶。生理生化特征見表3。2.3.416S rRNA的序列分析及構建系統發育N-J樹以菌株總DNA為模板，進行目的片段擴增，回收、測序。測序結果(1 434 bp 16S rRNA基因)提交至NCBIGenBank，獲得登錄號:JQ065718。將菌株16S rRNA基因序列與相近模式菌比對，構建進化樹。結果顯示，菌株與Streptomyces violaceorubidus LMG 20319T(AJ781374)最為接近，相似度為99.856%;兩者在進化樹上呈單獨1枝，為鏈霉菌的疑似種，確定為Streptomyce sp.。系統進化樹見圖5。

表3 菌株CS-1的生理生化特征Table 3 Physiological and biochemical characters of strain CS-1

圖5 基于16S rRNA基因序列構建的N-J系統發育樹Fig.5 Phylogenetic neighbour-joining tree based on the 16S rRNA gene sequences of strain CS-1 and related Streptomyces species

3 討論

用內生放線菌CS-1對鬼臼毒素進行微生物轉化，發現它能將鬼臼毒素轉化為4'-去甲基表鬼臼毒素，表明內生放線菌CS-1可能具有O-去甲基化酶，能在鬼臼毒素的甲氧酚上發生去甲基化反應，還可能具有異構化酶將C4位α構型轉化為β構型。并且這2種酶是同時或共同轉化鬼臼毒素，因為在實驗中沒有發現4'-去甲基鬼臼毒素或表鬼臼毒素這樣的中間體。由此可以推測，內生放線菌CS-1對鬼臼毒素的轉化路徑可能是由鬼臼毒素直接轉化為4'-去甲基表鬼臼毒素(圖6)。Hande［22］研究發現4'-去甲基表鬼臼毒素抗腫瘤活性增強，其抗腫瘤機制發生改變，鬼臼毒素是通過破壞正在進行有絲分裂細胞中的微管蛋白集結及微管的形成，使細胞有絲分裂停止在M期，抑制腫瘤細胞正常分裂，發揮抗腫瘤作用，而4'-去甲基表鬼臼毒素是通過抑制DNA拓撲異構酶Ⅱ的活性發揮抗腫瘤作用。因此，可以通過進一步改造4'-去甲基表鬼臼毒素獲得新的鬼臼類化合物，為抗腫瘤藥物篩選提供更多先導化合物。內生微生物(細菌、放線菌和真菌等)普遍存在于植物組織內，與宿主建立了密切的互惠共生關系。在這種復雜的相互作用中，內生微生物究竟扮演何種角色仍然不清楚。本研究也許能為這種相互作用的分子調控機制的理論探討，以及轉化天然產物的微生物的實驗篩選提供一條新的途徑。

圖6 CS-1對鬼臼毒素轉化途徑Fig.6 Podophyllotoxin transformation way by CS-1

［1］ Farkya S，Bisaria VS，Srivastava AK.Biotechnological aspects of the production of the anticancer drug podophyllotoxin［J］.Appl Microbiol Biotechnol，2004，65(5):504-519.

［2］ Canel C，Moraes RM，Dayan FE，et al.Podophyllotoxin［J］.Phytochemistry，2000，54(2):115-120.

［3］ Bohlin L，Rositn B.Podophyllotoxin derivatives:drug discovery and development［J］.Drug Discovery Today，1996，1(8):343-351.

［4］ Manso-Martinez R.Podophyllotoxin poisoning of microtubules at steady-state:effect of substoichiometric and superstoichiometric concentrations of drug［J］.Mol Cell Biochem，1982，45(1):3-11.

［5］ Hartmann FS，Albert W.The chemical and biological route from podophyllotoxin glucoside to etoposide.Ninth Cain Memorial Award Lecture［J］.Cancer Res，1991，51(1):5-15.

［6］ Jyothi P，Jagetia GC，Krishnamurthy H.Evaluation of teniposide(VM-26)-induced toxicity on mouse spermatogenesis by flow cytometry［J］.Toxicology，2001，163(2-3):163-174.

［7］ Castro MA，Corral JMM，Gordaliza M，et al.Chemo induction of cytotoxic selectivity in podophyllotoxin-related lignans［J］.Phytochemistry Reviews，2003，2(3):219-233.

［8］ Ishige T，Honda K，Shimizu S.Whole organism biocatalysis［J］.Curr Opin Chem Biol，2005，9(2):174-180.

［9］ Miyazawa M.Biotransformation of lignans and neolignans［J］.Curr Org Chem，2001，5(9):975-986.

［10］ Giri A，Dhingra V，Giri CC，et al.Biotransformations using plant cells，organ cultures and enzyme systems:current trends and future prospects［J］.Biotechnol Adv，2001，19(3):175-199.

［11］ De Carvalho CCCR，Da Fonseca MMR.Biotransformation of terpenes［J］.Biotechnol Adv，2006，24(2):134-142.

［12］ Rathbone DA，Bruce NC.Microbial transformation of alkaloids［J］.Curr Opin Microbiol，2002，5(3):274-281.

［13］ Guo HZ，Guo DA，Fei XY，et al.Biotransformation of podophyllotoxin to picropodophyllin by microbes［J］.J Asian Nat Prod Res，1998，1(2):99-102.

［14］ 楊世海，劉曉峰，果德安，等.9種活性物質在掌葉大黃組織培養系統中的生物轉化［J］.吉林農業大學學報，2005，27(4):408-412.

［15］ Broomhead AJ，Dewick PM.Biotransformation of podophyllum lignans in cell suspension cultures of Forsythia intermedia［J］.Phytochemistry，1991，30(5):1511-1517.

［16］ Teng RW，McManus D，Mau SL，Bacic A.Biotransformation of podophyllotoxin by Hordeum vulgare cell suspension cultures［J］.Biocatal Biotransform，2007，25(1):1-8.

［17］ Coombs J T，Franco C MM.Isolation and identification of actinobacteria from surface-sterilized wheat roots［J］.Appl Environ Microbiol，2003，69(9):5603-5608.

［18］ 徐麗華，李文均，劉志恒，等.放線菌系統學［M］.北京:科學出版社，2007:40-47.

［19］ Chun J，Lee JH，Jung Y，et al.EzTaxon:a web-based tool for the identification of prokaryotes based on 16S ribosomal RNA gene sequences［J］.Int J Syst Evol Microbiol，2007，57(10):2259-2261.

［20］ Tamura K，Dudley J，Nei M，et al.MEGA4:Molecular Evolutionary Genetics Analysis(MEGA)software version 4.0［J］.Mol Biol Evol，2007，24(8):1596-1599.

［21］ M.Kuhn，C.Keller-Jusle＇n，A.von Wartburì.Partialsynthese von 4＇-Demethylepipodophyllotoxin［J］.Helv Chim Acta，1969，52(4):944-947.

［22］ Hande KR.Etoposide:four decades of development of a topoisomerase II inhibitor［J］.Eur J Cancer，1998，34(10):1514-1521.