δ-睡眠肽與GFP融合蛋白的表達和純化

崔小進，楊帆，戴有金，李章富，呂永通，胡風慶

(遼寧大學生命科學院生物材料與生物制藥實驗室，遼寧沈陽110036)

Delta-睡眠肽(Delta sleep inducing peptide，DSIP)是一種存在于動物體內的促睡眠物質，由Monnier等［1］于1963年從被微電流刺激的家兔腦靜脈血通過體外血液透析等方法分離得到。Delta-睡眠肽為Trp-Ala-Gly-Gly-Asp-Ala-Ser-Gly-Glu 9個氨基酸所構成，是分子量為848.98 u的九肽［2］。將其注射到動物靜脈，可以增強慢波睡眠時相的Delta-波及睡眠梭形活動，即有促進睡眠的作用，故稱為Delta-睡眠肽。DSIP作用于睡眠的途徑并未得到透徹的研究，一些研究顯示DSIP是通過影響腦中血清素(serotonin)和γ-氨基酪酸(GABA)的釋放來產生促睡眠作用的［3］。研究還顯示內源性的DSIP參與了許多肽類激素的調控:它可以抑制促甲狀腺激素、促生長素抑制素的分泌，刺激促黃體激素、生長激素、促生長激素釋放激素的分泌［4-5］，此后隨著研究的深入，DSIP還被發(fā)現(xiàn)具有多種生理功能，因此被視為一種多功能的神經調節(jié)肽，這些功能中最顯著的生理活性就是其應激保護作用。DSIP作為一種應激限制因子(stresslimiting factor)可以降低環(huán)境中緊張因素對機體的損害，人體中內源性DSIP水平在35歲后會有升高來減少應激反應對機體的損害［6］。在免疫應答中，DSIP還可以起到免疫調節(jié)劑的作用，并能促進細胞分化兼具有抗腫瘤的作用［7］。DSIP具有降低體溫的特性［8］;DSIP還具有舒張血管的活性，高血壓的人或老鼠接受DSIP后，血壓會下降;DSIP具有調節(jié)晝夜節(jié)律的作用;DSIP還可以通過增強腦啡肽與鴉片受體的作用而產生鎮(zhèn)痛作用;DSIP具有抗酒精和抗鴉片活性，可抑制對于酒精和鴉片的依賴;另外DSIP還具有抗驚厥的作用。由于Delta-睡眠肽在體內的含量極少，分離純化起來，不但繁瑣且非常困難，加之又有了對Delta-睡眠肽一級結構的了解，人們開始試圖通過化學合成的方法來獲得Delta-睡眠肽，并且取得了一定的成功。早在1979年，就報道了Delta-睡眠肽及其類似物的合成工作［9］。此后，對其合成、生物活性及構效關系的研究均取得進一步發(fā)展，為其臨床應用提供了進一步的依據(jù)。本研究對DSIP基因進行克隆，構建載體pET-28a-DSIP，但由于目的編碼區(qū)過短，DSIP無法實現(xiàn)表達。在質粒pET-28a-DSIP中插入一段編碼含有265個氨基酸殘基的綠色熒光蛋白(green fluorescent protein，GFP)基因，通過融合表達的方法成功實現(xiàn)了DSIP的表達，并純化得到GFP-DSIP融合蛋白，為進一步研究DSIP的生物學作用奠定了基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 質粒與菌株原核表達載體pET-28a質粒，購自Novagen公司;pEGFP-C1表達載體以及E.coli BL21(DE3)菌株由本實驗室保存。

1.1.2 實驗試劑限制性內切酶，T4 DNA連接酶，DNA Marker，均購自TaKaRa公司;小量質粒提取試劑盒，Pfu高保真DNA聚合酶，RNA酶，DNA回收試劑盒，均購自上海生工生物工程公司;B型超純質粒小樣快速提取試劑盒，購自寶信生物技術有限責任公司;親和層析介質Ni-NTA His-Bind Resin，購自Qiaqing公司;其他試劑為進口或國產分析純。

1.2 方法

1.2.1 SOE PCR擴增DSIP基因序列根據(jù)DSIP基因序列設計引物，上游引入編碼腸激酶識別位點的堿基序列和EcoRⅠ酶切位點DSIP1:5'-TCCGAATTCGACGACGACGACAAATGGGCTGGTGGTGACGC-3'。下游引入XhoⅠ酶切位點DSIP2:5'-GTGCTCGAGATTATTCACCGGAAGCGTCACC-ACCAGCCCA-3'。利用上述引物進行SOE-PCR拼接延伸出整個DSIP基因及腸激酶識別位點序列。反應條件為95℃5 min。擴增產物經1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定正確后，用膠回收試劑盒純化并回收。

1.2.2 表達載體pET-28a-DSIP的構建用限制性內切酶EcoRⅠ和XhoⅠ對純化的DSIP目的片段和pET-28a質粒在37℃雙酶切過夜，產物經凝膠電泳后分別純化回收。在16℃，T4連接酶作用下，將DSIP片段和pET-28a過夜連接，然后轉化E.coli BL21(DE3)，篩選陽性轉化子，測序鑒定。

1.2.3 綠色熒光蛋白基因的PCR擴增根據(jù)GFP基因序列設計引物，上游引入NdeⅠ酶切位點GFP1:5'-GTACATATGATGGTG AGCAAGGGCGAG-3'。下游引入酶切位點BamHⅠGFP2:5'-ATTGAATTCTCTAGATCCGG TGGAGCCC-3'，以質粒pEGFP-C1為模板，通過PCR擴增GFP。反應條件:95℃預變性5 min，94℃變性45 s，58℃退火60 s，72℃延伸45 s，30個循環(huán)，最后72℃充分延伸7 min。擴增產物經1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定正確后，用膠回收試劑盒純化并回收。

1.2.4 表達載體pET28a-GFP-DSIP的構建GFP基因PCR擴增產物經限制性內切酶NdeⅠ和BamHⅠ雙酶切后插入到載體pET-28a-DSIP，然后轉化E.coli BL21(DE3)，挑取陽性克隆雙酶切鑒定，測序鑒定。

1.2.5 重組質粒的誘導表達將測序鑒定正確的重組質粒轉化到BL21表達菌種中，進行誘導表達。菌液經37℃振揺培養(yǎng)過夜后以1∶100比例接種到新鮮培養(yǎng)基中，培養(yǎng)至OD600值約為0.6時，加入終濃度為1 mmol/L的IPTG，30℃繼續(xù)振搖培養(yǎng)4 h，收菌進行聚丙烯凝膠電泳(SDSPAGE)鑒定誘導表達產物。

1.2.6 融合蛋白的純化取過夜培養(yǎng)菌液10 mL，接入200 mL含Kan(40 μg/mL)的LB培養(yǎng)基，37℃，200 r/min振蕩培養(yǎng)至OD600達到0.6后IPTG誘導蛋白表達，培養(yǎng)結束后離心收集菌體;將菌體重懸于4 mL結合緩沖液中，加入溶菌酶至1 mg/mL，超聲破碎菌體后離心去除不溶性細胞碎片。收集上清參照鎳親和層析柱使用說明過鎳親和層析柱純化融合蛋白。

2 結果與分析

2.1 重組質粒pET28a-GFP-DSIP的構建

2.1.1 DSIP的SOE PCR擴增結果根據(jù)設計的引物DSIP1和DSIP2，SOE PCR擴增DSIP，擴增產物經1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，PCR產物大小為57 bp，預期結果基本一致，結果見圖1。

圖1 SOE PCR擴增DSIP基因結果Fig.1 SOE PCR of DSIP

2.1.2 GFP的PCR擴增結果根據(jù)設計的引物GFP1和GFP2，PCR擴增GFP，擴增產物經1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，PCR產物大小為798 bp，預期結果基本一致，結果見圖2。

圖2 綠色熒光蛋白基因的PCR擴增結果Fig.2 PCR of GFP

2.1.3 重組質粒的鑒定結果用BamHⅠ和NdeⅠ酶切重組質粒，1%瓊脂糖凝膠電泳分析得到789和5 360 bp左右2條條帶，與預期相符，該重組質粒經酶切電泳鑒定正確，結果見圖3。

圖3 pET28a-GFP-DSIP雙酶切驗證結果Fig.3 Identification of pET28a-GFP-DSIP by digesting with restiction enzymes

對重組質粒中插入的序列進行測序鑒定，經Blast序列分析軟件比對，結果表明，GFP以及DSIP基因正確插入到了pET-28a載體中，成功構建了pET28a-GFP-DSIP重組載體。

2.2 重組GFP-DSIP融合蛋白的表達純化鑒定結果

表達質粒pET28a-GFP-DSIP經1 mmol/L IPTG于30℃誘導4 h，SDS-PAGE結果顯示轉化表達質粒株菌誘導后有1條明顯的融合蛋白表達條帶。從圖4中可以看出GFP-DSIP融合肽的分子量與預期大小(32 ku)相符。融合蛋白經Ni-NTA親和層析柱分離純化后，在SDS-PAGE中顯示出預期大小的純化后的蛋白條帶(圖4)。

圖4 GFP-DSIP誘導表達及純化的SDS-PAGE分析Fig.4 SDS-PAGE of expression and purification of GFP-DSIP

3 討論

自從發(fā)現(xiàn)Delta-睡眠肽，一些驗證DSIP是主要的內源性睡眠因子的假說的研究便被開展起來，人們考慮用它來治療失眠［10］，很多研究已經證實這一想法。Delta-睡眠肽已經被描繪成一種睡眠促進物質而不是一種鎮(zhèn)靜劑。

應用現(xiàn)代分子生物學方法和基因工程手段，通過原核表達系統(tǒng)來獲得Delta-睡眠肽將為Delta-睡眠肽的內源性和生物合成等一系列問題提供重要的信息，也可能會為Delta-睡眠肽的臨床應用提供良好的發(fā)展契機，對促進人們對于睡眠的認識將有很大的意義，也將為患睡眠障礙的病人貢獻一個新致眠藥物提供了可能性。

本研究通過SOE-PCR方法擴增到帶有腸激酶識別位點和DSIP九肽的編碼序列，經酶切、連接構建表達載體pET-28a-DSIP。以pEGFP-C1為模板擴增出GFP的基因，插入pET-28a-DSIP中構建表達載體pET-28a-GFP-DSIP，轉化E.coli BL21(DE3)，利用IPTG誘導表達獲得大量可溶性表達產物。可溶性蛋白經Ni-NTA親和層析柱純化，SDS-PAGE電泳分離，考馬斯亮藍染色分析，呈現(xiàn)一條帶，證明本研究成功構建融合蛋白GFPDSIP，其純度達電泳純。

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