葡枝根霉TP-02中的內切葡聚糖苷酶基因在枯草芽胞桿菌WB600中的克隆和表達

黃輝，湯斌

(安徽工程大學微生物發酵安徽省工程技術研究中心，安徽蕪湖241000)

纖維素是世界上最大的可再生資源，通過降解可轉化為人類急需的能源、食物、化工原料，對于人類社會解決食物短缺和能源危機具有重大現實意義［1-3］。利用微生物產生的纖維素酶(cellulase)來分解和轉化纖維素則是纖維素利用的有效途徑。纖維素酶由內切葡聚糖苷酶(EG)、外切葡聚糖苷酶(CBH)和β-葡萄糖苷酶(BG)3種組分構成［4-5］。各組分協同作用，可以將木質纖維素水解為葡萄糖。其中EG優先作用于無定形纖維素，切割β-1，4主鍵，進而由外切葡聚糖苷酶和β-葡萄糖苷酶完成徹底降解［6］。目前，纖維素酶基因的克隆與表達的研究已經成為纖維素酶分子生物學研究的熱點［7-8］。隨著纖維素酶分子生物學的研究不斷深入，越來越多的纖維素酶基因被克隆與表達。來源于纖維素降解微生物的纖維素酶基因的異源表達，使用最多的宿主就是大腸埃希菌和畢赤酵母。然而，在安全性、生產技術及蛋白分泌等方面，枯草芽胞桿菌比大腸埃希菌更具作為表達宿主的優勢［9］。由于枯草芽胞桿菌自身分泌蛋白酶多，容易對獲得目的蛋白產生影響。本研究選擇缺失6種胞外蛋白酶基因(中性蛋白酶A、枯草溶菌素、胞外蛋白酶、金屬蛋白酶、桿菌肽酶F和中性蛋白酶B)的枯草芽胞桿菌WB600作為宿主菌，最終成功得到表達。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株、質粒和引物葡枝根霉TP-02是從黃山生態林腐爛的枯草中篩選并保存［10］。用于雙鏈合成的含有HindⅢ酶切位點的錨定引物:5＇-(T)18AAGCTT(AG)10，由上海生物工程技術服務公司合成。pMA5和枯草芽胞桿菌WB600均為江南大學惠贈。基因操作相關的酶和試劑盒購自TaKaRa公司。

1.1.2 培養基PDA培養基:葡萄糖-馬鈴薯培養基;纖維素酶誘導培養基:CMC-Na 0.4%，KH2PO40.2%，(NH4)2SO40.14%，尿素0.03%，MgSO40.03%，CaCl20.03%，FeSO45 mg/L，MnSO41.56 mg/L，ZnSO41.4 mg/L，CoCl22.0 mg/L，胰蛋白胨0.75 mg/L，酵母浸出物0.25 g/L;LB培養基:蛋白胨1%，酵母粉0.5%，NaCl 1%，pH 7.0;陽性克隆篩選培養基(LB-CMC-Na培養基):蛋白胨1%，酵母膏0.5%，NaCl 1%，CMC-Na 1%，瓊脂2%～3%，pH 7.1～7.2;重組菌發酵培養基:CMC-Na 1.5%，(NH4)2SO40.3%，KH2PO40.1%，MgSO40.05%。

1.2 方法

1.2.1 葡枝根霉TP-02總RNA的提取用PDA培養基培養活化葡枝根霉TP-02。然后用誘導培養基誘導葡枝根霉產纖維素酶。當發酵時間為72 h時，加入L-山梨糖，終濃度為2 g/L。再繼續培養12 h。12 h后離心收集菌體。棄去上清液。用蒸餾水洗滌菌體2次，用液氮研磨。研磨后菌體用于總RNA抽提，用Trizol法提取總RNA［11］。

1.2.2 mRNA的分離將提取獲得的總RNA加入含有0.5 mg Oligo-dt cellulose的EP管中，室溫溫浴30 min，其間混勻數次。將溶液轉到含有吸附柱的1.5 mL的EP管中，4℃離心，加入10 μL RNA-Free水溶解獲得mRNA［12］。

1.2.3 cDNA的合成和雙酶切以葡枝根霉TP-02的mRNA做模板，用反轉錄酶合成雙鏈cDNA。合成后純化，再用連接試劑盒將雙鏈與含有EcoRⅠ酶切位點的接頭連接。用HindⅢ、EcoRⅠ酶酶切雙鏈cDNA。

1.2.4 pMA5質粒的抽提和雙酶切在37℃轉速200 r/min的條件下，在LB培養基中培養Escherichia coli DH5α，直到OD值達到0.5。4 000 r/min離心6 min，獲得菌體。用堿裂解法提取pMA5質粒［13-14］。根據TaKaRa限制性內切酶應用手冊，用限制性內切酶EcoRⅠ和HindⅢ雙酶切質粒。

1.2.5 cDNA文庫構建和篩選用DNA連接試劑盒中連接酶連接雙酶切后的cDNA與雙酶切后的質粒pMA5。上述連接產物用電極轉化的方法轉入枯草芽胞桿菌WB600中。在LB平板上30℃培養重組枯草芽胞桿菌，直到重組子長出并獲得cDNA文庫。將在LB平板上生長的菌轉移到LB-CMC平板上37℃條件下培養2 d后將篩選得到的陽性克隆進行序列測定。

1.2.6 枯草芽胞桿菌WB600及陽性克隆內切葡聚糖苷酶的活性檢測在37℃和轉速150 r/min的條件下，在250 mL含有50 mL的LB培養基中培養對應序列的陽性克隆，培養到菌體的對數生長期。按5%的接種量將菌液接種到CMC-Na培養基中，在37℃和轉速150 r/min的條件下培養。每隔6 h取1 mL培養液，測其內切葡聚糖苷酶酶活。分別取稀釋的酶液1 mL，與1 mL 1%的CMC-Na溶液(溶解于pH 4.8，0.2 mol/L HAc-NaAc緩沖溶液中)混合。50℃反應30 min后，加入3 mL DNS，沸水浴5 min，冷卻，加水定溶到25 mL。振蕩混勻后在520 nm測其OD值。1個單位的酶活(IU)被定義為每分鐘生成1 μmol的葡萄糖所需的酶量［15］。

1.2.7 內切葡聚糖酶的純化和SDS-PAGE電泳

菌體在CMC-Na液體培養基中培養36 h后，收集上清液。用硫酸銨濃縮后，得到的沉淀用20 mmol/L的醋酸鹽溶解和透析。取5 mL處理好的發酵上清液上Sephadex G-100層析柱，用pH 4.8的0.1 mol/mL醋酸-醋酸鈉緩沖液洗脫，洗脫速度為10 mL/h，每管收集4 mL，在280 nm測定各管光吸收值，并測定各管的內切葡聚糖苷酶活力。每個樣品20 μL與蛋白質沉降緩沖溶液混合，煮沸3 min，離心取上清點樣。膠用1%的考馬斯亮藍染色30 min，用40%的甲醇洗3次。通過與蛋白質標樣進行比對可以得出目的蛋白的分子量大小。

2 結果與分析

2.1 葡枝根霉TP-02總RNA的1%凝膠電泳

圖1中泳道1和泳道2均為所提取的根霉TP-02的總RNA。從圖1中可以很清楚的看到總RNA的3條帶:5S、18S、28S。而且幾乎沒有降解，可以用于mRAN的分離。

圖1 根霉TP-02總RNAFig.1 Total RNA of Rhizopus stolonifer var.reflexus TP-02

2.2 pMA5質粒圖譜

本研究選用了多克隆位點中的EcoRⅠ和HindⅢ2個酶切位點(圖2)。

圖2 pMA5質粒圖譜Fig.2 Map of plasmid pMA5

2.3 陽性克隆的篩選

將cDNA文庫重組子涂布于LB-CMC平板上，形成單菌落后，用1%剛果紅溶液染色1 h，然后用1%的NaOH溶液進行脫色固定染色圈。羧甲基纖維素鈉(CMC-Na)能和剛果紅發生劇烈反應使得平板被染成紅色。重組菌能夠利用羧甲基纖維素鈉從而使得菌落周圍出現透明圈(圖3)，從而可以很便捷地篩選到陽性克隆。

圖3 陽性克隆篩選結果Fig.3 The result of positive clone screening

2.4 測序以及序列分析

將陽性克隆送至上海生工生物工程技術服務有限公司測序，經測序獲得2個不同的序列，分別命名為eg2和eg3。其登錄號為HM043656和HM043657。經NCBI比對，eg2與米根霉RCE3的內切葡聚糖苷酶的相似性為65%，eg3與米根霉RCE1的內切葡聚糖苷酶的相似性為67%。所以此2個序列為編碼內切葡聚糖苷酶的新序列。

2.5 枯草芽胞桿菌WB600生長曲線

由圖4可知，枯草芽胞桿菌WB600沒有經過延緩期，直接進入對數生長期，0～8 h生長很快，9 h后生長速度逐漸變慢，32 h進入生長穩定期，40 h后生長進入衰退期。

圖4 枯草芽胞桿菌WB600的生長Fig.4 Growth of Bacillus subtilis WB600

2.6 枯草芽胞桿菌WB600及陽性克隆內切葡聚糖苷酶酶活測定

枯草芽胞桿菌WB600于37℃、150 r/min培養，每隔6 h取樣測定內切葡聚糖苷酶酶活，測定至72 h均未檢測到酶活，可以確定枯草芽胞桿菌WB600本身并不產內切葡聚糖苷酶。進一步驗證以上2個基因編碼內切葡聚糖苷酶，在含有CMC-Na培養基的搖瓶中培養陽性克隆，并每隔6 h測其酶活。圖5顯示出重組枯草芽胞桿菌WB600的發酵特性。發酵36 h后，重組枯草芽胞桿菌WB600的eg2與eg3編碼的內切葡聚糖苷酶酶活分別達到峰值為1.174和1.034 IU/mL。

圖5 eg2和eg3編碼的內切葡聚糖苷酶酶活Fig.5 Activity of endoglucanase coded by eg2 and eg3

圖6 根霉TP-02內切葡聚糖苷酶酶活Fig.6 Endoglucanase activity of Rhizopus TP-02

枯草芽胞桿菌作為宿主菌在安全性、生產技術和蛋白質分泌等方面都比大腸埃希菌、畢赤酵母等要更好些，然而枯草芽胞桿菌自身分泌蛋白酶多，容易對獲得目的蛋白產生影響。本研究所用的枯草芽胞桿菌WB600是缺失6種胞外蛋白酶基因的枯草芽胞桿菌，大大減少了對目的蛋白的影響。枯草芽胞桿菌是原核生物，生長繁殖和代謝能力都很強，從圖5和圖6可以看出，重組菌在36 h時酶活就達到了頂峰，而出發菌株根霉TP-02酶活達到最大值時的時間為90 h，發酵周期縮短了54 h。

2.7 SDS-PAGE電泳

柱純化后，對純化產物進行SDS-PAGE電泳。從圖7中，可以得出eg2和eg3編碼的蛋白的分子量大約分別在44和46 ku，并且條帶單一而且清晰。

圖7 SDS-PAGE電泳Fig.7 SDS-PAGE electrophoresis

SDS-PAGE電泳條件:膠濃度:5%的濃縮膠，12%的分離膠;緩沖液:濃縮膠緩沖液為0.5 mol/L Tris-HCl，pH 6.8，分離膠緩沖液為1.5 mol/L Tris-HCl，pH 8.8，電極緩沖液為Tris 3 g，甘氨酸14.4 g，SDS 1.0 g，加重蒸水至1 000 mL，pH 8.3;電壓:180 V;染色劑:考馬斯亮藍R250。

3 討論

本研究利用構建cDNA表達文庫的方法成功分離出2種新的內切葡聚糖苷酶基因(eg2和eg3)。通過發酵在36 h測得酶活最大值分別為1.174和1.034 IU/mL。發酵液經純化分離后用SDS-PAGE電泳測得EGⅡ、EGⅢ分子量分別為44、46 ku。

本研究使用的宿主菌為缺失6種胞外蛋白酶基因的枯草芽胞桿菌WB600，降低了對目的蛋白降解的可能性，同時該表達為分泌性表達，也給目的蛋白的分離純化帶來了便利。

本研究雖然成功地進行了異源表達并檢測到一定的活性，但是酶活力不是很理想。出現這種結果有以下幾個原因:①選用的2個酶切位點是位于MCS2，導致目的基因離啟動子比較遠，使得轉錄效率降低;②使用的pMA5載體拷貝數較低，使得目的基因的復制倍數較少，從而導致酶活不高。今后將從這兩方面著手繼續下面的研究。

［1］ Bakare，M.K.，Adewale，I.O.，A.Ajayi，et al.Purification and characterization of cellulose from the wild-type and two improved mutants of Pseudomonas fluorescens［J］.African Journal of Biotechnology，2005，4(9):898-904.

［2］ Nóra Szijártó，Zsófia Faigl，Kati Réczey，et al.Cellulase fermentation on a novel substrate(waste cardboard)and subsequent utilization of home-produced cellulase and commercial amylase in a rabbit feeding trial［J］.Industrial Crops and Products，2004，20(1):49-57.

［3］ 吉海平，王風斌.淺談微生物在秸桿生物學轉化中的應用［J］.生物工程進展，1997，17(2):56-59.

［4］ Henning J?rgensen，Jorg P.Kutter，Lisbeth Olssona.Separation and quantification of cellulases and hemicellulases by capillary electrophoresis［J］.Analytical Biochemistry，2003，317(1):85-93.

［5］ Xiaohong Zhou，Hongzhang Chen，Zuohu Li.CMCase activity assay as a method for cellulase adsorption analysis［J］.Enzyme and Microbial Technology，2004，35:455-459.

［6］ Glazer AN，Nikaido H.Microbial Biotechnology.NewYork:W.H.Freeman and Company，1995.

［7］ 李燕紅，趙輔昆.纖維素酶的研究進展［J］.生命科學，2005，17(5):392-397.

［8］ André O.S.Lima，Maria C.Quecine，Maria H.P.Fungaro，et al.Molecular characterization of a β-1，4-endoglucanase from an endophytic Bacillus pumilus strain［J］.Appl Microbiol Biotechnol，2005，68(1):57-65.

［9］ 沈衛鋒，牛寶龍，翁宏飚，等.枯草芽胞桿菌作為外源基因表達系統的研究進展［J］.浙江農業學報，2005，17(4):234-238.

［10］ 潘海波.利用DNA體外重組技術構建高活性纖維素酶基因工程菌［D］.安徽工程大學，2010.

［11］ 林玲，楊燕凌，何海福，等.總RNA提取方法的比較與分析［J］.武夷科學，2009，25(1):97-100.

［12］ Tang B，Pan HB，Zhang QQ，et al.Cloning and expression of cellulase gene EG1 from Rhizopus stolonifer var.reflexus TP-02 in Escherichia coli［J］.Bioresour Technol，2009，100(23):6129-6132.

［13］ Jason W，Martin J，Florian W.Extraction of plasmid DNA using reactor scale alkalinelysis and selective precipitation for scalable transient transfection［J］.Cytotechnol，2001，35(3):165-173.

［14］ Li X，Jin H，Wu Z，et al.B.An automated process to extract plasmid DNA by alkalinelysis［J］.Appl Microbiol Biotechnol，2007，75(5):1217-1223.

［15］ Pajni S，Dhillon N，Vadehra DV，et al.Carboxymethyl cellulase，β-glucosidase and xylanase production by Bacillus isolates from soil［J］.Int Biodeterior，1989，25(1-3):1-5.