Tetramycin抗性基因克隆及生物活性的測定

陳飛，吳紅艷，桓明輝，關(guān)艷麗，郭玲玲，于廣峰

(遼寧省微生物科學(xué)研究院，遼寧朝陽122000)

Tetramycin是鏈霉菌(Streptomyces ahygroscopicus wuzhouensis subsp 11371)產(chǎn)生的具有抗真菌作用的抗生素，但產(chǎn)Tetramycin的能力低，生產(chǎn)成本高，不能滿足市場需求。研究表明，Tetramycin的抗性基因參與了抗生素的合成調(diào)控，與抗生素合成基因成簇并存，在抗生素合成過程中起激活或限速作用，且抗性水平與抗生素合成呈正相關(guān)［1-2］。據(jù)此，本文對Tetramycin抗性基因進(jìn)行了克隆及生物活性的測定，為進(jìn)一步研究Tetramycin生物合成基因簇、提高Tetramycin產(chǎn)量提供理論數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗菌株鏈霉菌11371(Streptomyces ahygroscopicus wuzhouensis subsp 11371)菌株，由遼寧省微生物科學(xué)研究院菌種保藏中心提供;大腸埃希菌DH5α，購自科海軍舟生物制品公司;畢赤酵母菌種GS115，畢赤酵母表達(dá)載體pPICZαA，由首都醫(yī)科大學(xué)朱俊平博士惠贈。

1.1.2 培養(yǎng)基LB培養(yǎng)基，YEPD培養(yǎng)基，YEPDS培養(yǎng)基，高氏一號培養(yǎng)基。

1.1.3 試劑溶菌酶、X-gal，IPTG，Taq酶，T4-連接酶，限制性內(nèi)切酶XbaⅠ、EcoRⅠ、PstⅠ、Sau3AⅠ、博來霉素(Zencin)等購自北京科海軍舟有限公司;Tetramycin由遼寧省微生物科學(xué)研究院提供。

1.2 方法

1.2.1 抗性基因的克隆及序列測定［3-4］①鏈霉菌11371基因組DNA的提取:提取鏈霉菌基因組DNA，沉淀溶于0.1×SSC中，－20℃保存?zhèn)溆茫?］;②鏈霉菌11371抗性基因PCR擴(kuò)增:不同鏈霉菌次級代謝中抗性基因具有一定同源性，根據(jù)已知鏈霉菌抗性基因的保守核苷酸序列設(shè)計簡并引物，以鏈霉菌11371基因組DNA為模板進(jìn)行克隆，獲得鏈霉菌11371抗性基因片段1-2-1和2-1-1;③抗性基因擴(kuò)增產(chǎn)物純化:PCR產(chǎn)物可以直接利用純化試劑盒進(jìn)行純化;④抗性基因擴(kuò)增產(chǎn)物酶切:按照表1均勻混合各溶液，37℃保溫1～3 h;⑤抗性基因酶切片段與載體pUCm-T連接:根據(jù)Taq酶PCR擴(kuò)增產(chǎn)物末端有A堿基與pUCm-T線性載體末端T堿基配對的特點，摸索擴(kuò)增產(chǎn)物和載體的連接比例，按照T4-連接酶反應(yīng)條件，進(jìn)行純化產(chǎn)物與載體DNA的連接。連接體系(10 μL體系):擴(kuò)增純化產(chǎn)物4 μL，載體DNA 1 μL，10×連接緩沖液1 μL，T4-連接酶1 μL，ddH2O:3 μL。16℃連接4 h;⑥連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化及轉(zhuǎn)化子鑒定:將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸埃希菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，挑取白色和蘭色轉(zhuǎn)化斑至LB液體培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)12 h，提取質(zhì)粒［6］。根據(jù)載體上的酶切位點進(jìn)行酶切鑒定，1%瓊脂糖凝膠電泳檢測;⑦抗性基因測序及分析:選擇鑒定為陽性的轉(zhuǎn)化子，送至大連寶生物工程有限公司進(jìn)行序列測定。測定結(jié)果利用生物軟件和GenBank進(jìn)行同源性等比較。

表1 10μL酶切反應(yīng)體系Table 110 μL enzyme cut reactor system

1.2.2 抗性基因生物活性的測定①畢赤酵母GS115表達(dá)抗性基因序列的獲得:通過BioEdit和DNAstar分析1-2-1和2-1-1 2條序列開放式閱讀框架，設(shè)計特異性引物，進(jìn)行PCR擴(kuò)增開放式閱讀框架序列。擴(kuò)增體系為模板2 μL，引物各2 μL，dNTP 2 μL，10×PCR-buffer 2.5 μL，Taq酶0.5 μL，用ddH2O補足20 μL。擴(kuò)增條件為95℃5 min預(yù)變性，94℃1 min，59.5℃1 min，72℃1.5 min，30個循環(huán)，72℃10 min。擴(kuò)增引物:1-2-1:5'-ACTCTAGAGCGAGGAATGGTGATGGTG-3'，5'-ACTCTAGAGCTACCCGAAAGGTTCTCAA-3'，2-1-1:5'-AGAATCCAGTAATGGGGATGGTGGTGC-3'，5'-ACTCCAGAGCTCGTAAGATTCAGTACCCAA G-3'，開放式閱讀框架包括堿基數(shù)為1-2-1，629 bp;2-1-1，421 bp;②抗性基因表達(dá)序列與畢赤酵母表達(dá)載體pPICZαA連接、轉(zhuǎn)化、鑒定:1-2-1和pPICZαA分別用XbaⅠ單酶切，2-1-1和pPICZαA分別用XbaⅠ和EcoRⅠ雙酶切，10 μL體系，37℃酶解2 h。酶切產(chǎn)物用低熔點瓊脂糖方法純化回收。按抗性基因∶表達(dá)載體=6∶1的比例進(jìn)行連接，由于pPICZαA為大腸埃希菌L與畢赤酵母的穿梭質(zhì)粒，所以將連接的產(chǎn)物轉(zhuǎn)化入大腸埃希菌DH5α中，利用Zencin抗性篩選陽性克隆;③連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化入畢赤酵母GS115:按照酵母轉(zhuǎn)化試劑盒的方法進(jìn)行轉(zhuǎn)化，涂布于含100 μg/mL Zencin的YEPDS培養(yǎng)基中，28℃培養(yǎng)，篩選具有Zencin抗性的陽性重組畢赤酵母;④抗性基因在畢赤酵母中的表達(dá)及生物活性的測定:將鑒定為陽性的重組畢赤酵母在YEPD中28℃培養(yǎng)30 h后，加入1%甲醇誘導(dǎo)，繼續(xù)培養(yǎng)48 h，獲得重組畢赤酵母發(fā)酵液，提取畢赤酵母GS115培養(yǎng)物總?cè)旧wDNA，以抗性基因擴(kuò)增引物為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，通過電泳觀察抗性基因在畢赤酵母GS115中的整合情況。將發(fā)酵液涂布平板上作為指示菌，用25 mg/mL的Tetramycin溶液作用于指示菌，通過觀察抑菌圈的大小測定抗性基因生物活性，同時以畢赤酵母原始菌株作對照試驗。

2 結(jié)果與分析

2.1 抗性基因克隆與序列測定

2.1.1 抗性基因的克隆結(jié)果(圖1)

圖1 抗性基因的PCR擴(kuò)增結(jié)果Fig.1 PCR amplification result of resistance gene

2.1.2 抗性基因的純化結(jié)果(圖2)

圖2 抗性基因的純化結(jié)果Fig.2 Purification effect of resistance gene

2.1.3 抗性基因的轉(zhuǎn)化子質(zhì)粒酶切鑒定結(jié)果(圖3)

圖3 陽性克隆斑酶切鑒定結(jié)果Fig.3 Enzyme cut certification of positive cloning

2.1.4 抗性基因的測序結(jié)果及插入序列酶切和PCR鑒定將質(zhì)粒載體送至大連寶生物公司進(jìn)行序列測定，結(jié)果如下:

①2-1-1(439 bp)測序結(jié)果:

包括引物在內(nèi)共439個堿基，與酶切片斷分子量相同，說明測序正確。

②1-2-1(757 bp)測序結(jié)果:

包括引物在內(nèi)共757個堿基，與酶切片斷分子量相同，說明測序正確。

③1-2-1和2-1-1插入序列酶切鑒定結(jié)果(圖4):理論分析1-2-1有3個內(nèi)切酶位點，切下3條明顯條帶;2-1-1有19個Sau3AⅠ內(nèi)切酶位點，大于100 bp的有4條條帶，電泳結(jié)果表明鑒定與理論相符合。通過GenBank數(shù)據(jù)同源性比較，1-2-1基因片段與數(shù)據(jù)庫所收錄的2條基因具有同源性，同源性在42%，其中與鏈霉菌有關(guān)有1條基因，但其功能未確定。2-1-1同源性與鏈霉菌相關(guān)的基因有30條，同源性最高的為93%，最低為40%，其中編碼細(xì)胞色素蛋白P450的基因有18條，說明鏈霉菌11371抗性基因編碼的蛋白有可能是細(xì)胞色素蛋白，在Tetramycin生物合成過程中參與催化內(nèi)源性底物和外源性化學(xué)物質(zhì)的單加氧化反應(yīng)。

圖41 -2-1和2-1-1插入序列酶切鑒定結(jié)果Fig.4 Insert sequence enzyme cut effect of 1-2-1＆2-1-1

2.2 抗性基因的表達(dá)及活性測定

2.2.1畢赤酵母表達(dá)用抗性基因序列擴(kuò)增及純化結(jié)果以測序用的1-2-1和2-1-1的工程菌質(zhì)粒DNA為模板，進(jìn)行抗性基因開放式閱讀框架的擴(kuò)增。結(jié)果見圖5、圖6。

圖5 抗性基因ORF的擴(kuò)增結(jié)果Fig.5 Amplification effect of resistance gene ORF

圖6 擴(kuò)增產(chǎn)物純化結(jié)果Fig.6 Purification effect of amplification products

2.2.2 抗性基因與pPICZαA連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化子PCR鑒定結(jié)果(圖7)

圖7 陽性克隆的PCR鑒定結(jié)果Fig.7 PCR certification of positive coning

2.2.3 抗性基因的表達(dá)及生物活性的測定結(jié)果

①抗性基因在畢赤酵母GS115中的整合結(jié)果見圖8;②抗性基因生物活性的測定(圖9):通過PCR鑒定結(jié)果證明抗性基因已轉(zhuǎn)化入載體中，選取陽性克隆，液體培養(yǎng)，誘導(dǎo)表達(dá)，測定抗性基因的生物活性。

圖8 PCR鑒定抗性基因在畢赤酵母中的整合Fig.8 Integration of PCR certification resistance gene in Pichia yeast

圖9 抗性基因生物活性的測定結(jié)果Fig.9 Biological activity certification of resistance gene

通過觀察抑菌圈的大小，圖9中A、B、C抑菌圈無明顯變化，表明重組畢赤酵母GS115陽性克隆并沒有表現(xiàn)出對Tetramycin明顯的抑制作用。

3 討論

鏈霉菌抗生素普遍存在于環(huán)境中(尤其是土壤環(huán)境中)，對細(xì)菌的生存造成了壓力。在長期的進(jìn)化過程中，抗生素抗性基因在細(xì)菌中已經(jīng)普遍存在。在非抗生素產(chǎn)生菌中，抗生素抗性基因的表達(dá)主要是為了應(yīng)對環(huán)境的抗生素壓力，而抗生素產(chǎn)生菌(如鏈霉菌)除了受到環(huán)境中的抗生素壓力外，還首當(dāng)其沖地受到自身所產(chǎn)生的抗生素的壓力。因而其抗生素抗性基因的表達(dá)與調(diào)控機制就比非抗生素產(chǎn)生菌復(fù)雜，抗生素抗性基因參與了抗生素的合成調(diào)控，以確保抗生素抗性的及時表達(dá)，從而免受自身抗生素的破壞［7-9］。

本試驗根據(jù)鏈霉菌抗性基因的保守序列設(shè)計引物，以鏈霉菌11371基因組DNA為模板，PCR擴(kuò)增出2條抗性基因DNA片段，對其序列進(jìn)行測定，并分析2條抗性基因的開放閱讀框架，根據(jù)序列設(shè)計表達(dá)引物，使其在畢赤酵母GS115中進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，測定抗性基因的生物活性。但是重組畢赤酵母GS115陽性克隆并沒有表現(xiàn)出對Tetramycin拮抗作用的提高，其中可能的原因:①鏈霉菌基因組DNA中有較高的G+C含量，畢赤酵母表達(dá)體系存在密碼子偏好存在，使得鏈霉菌的基因不能在畢赤酵母中正常表達(dá);②在篩選大腸埃希菌L陽性重組克隆時酶切鑒定出現(xiàn)不穩(wěn)定現(xiàn)象:外源片段在酶切過程中不是每次進(jìn)行酶切實驗都出現(xiàn)相同的陽性結(jié)果，說明抗性基因在大腸埃希菌和畢赤酵母中不穩(wěn)定;③抗性基因在畢赤酵母中表達(dá)條件不合適，不能大量表達(dá)抗性基因，利用現(xiàn)有檢測手段不能檢測出來;④克隆的抗性基因本身不存在抗Tetramycin的能力，不能提高敏感菌對Tetramycin的抗性。

但鏈霉菌11371 Tetramycin抗性基因的克隆仍具有如下研究意義［10-12］:①有助于闡明抗生素合成調(diào)控的途徑:抗生素抗性基因在抗生素合成過程中起著重要的調(diào)控作用，對抗生素抗性基因抗性機制的研究有助于闡明抗生素的生物合成及調(diào)控途徑;②先分離抗性基因，再分離合成基因簇，已經(jīng)成為一個經(jīng)典的克隆策略:由于在多數(shù)情況下，抗生素合成基因與抗性基因緊密連鎖，這一特性為分離抗生素合成基因簇提供了方便。可以先在某種抗生素敏感菌株中克隆該抗生素的抗性基因，然后以抗性基因為探針，從基因組DNA文庫中克隆抗生素生物合成基因簇，這已經(jīng)成為克隆抗生素生物合成基因簇的一個經(jīng)典策略。已有多種抗生素生物合成基因簇通過這一策略得以分離，如從龜裂鏈霉菌分離的土霉素生物合成基因簇;③篩選高抗性菌株以分離抗生素高產(chǎn)菌株:人們發(fā)現(xiàn)抗生素的抗性水平與抗生素的產(chǎn)量之間有一定的聯(lián)系，并把提高抗性水平作為獲得抗生素高產(chǎn)菌株的途徑之一。提高野生鏈霉菌菌株中的抗性基因拷貝數(shù)，不僅能夠提高菌株的抗性水平，還可以提高單位菌體的抗生素產(chǎn)量;④用作載體選擇標(biāo)記:隨著天藍(lán)色鏈霉菌和淺青紫鏈霉菌抗生素合成相關(guān)基因克隆的報道，鏈霉菌分子遺傳學(xué)進(jìn)入了一個嶄新的時代。在早期克隆的基因中，發(fā)現(xiàn)有幾個基因能夠賦予受體菌以抗生素抗性，很快被用做克隆載體的選擇工具。如表達(dá)硫鏈絲菌素(thiostrepton)抗性的rL2已經(jīng)在鏈霉菌多種克隆載體上用做選擇標(biāo)記發(fā)展到現(xiàn)在，如果沒有抗生素抗性基因的幫助，分子生物學(xué)實驗是不可想象的。

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