一個遲發(fā)性非綜合征型常染色體顯性遺傳性聾家系表型特征及致病基因初步探討△

王鴻涵 馮永 王行煒梅凌云陳紅勝蔣璐 門美超張華 李海波 劉亞蘭盧焰梅賀楚峰

1 中南大學湘雅醫(yī)院 耳鼻咽喉頭頸外科(長沙 410008)； 2 耳鼻咽喉重大疾病研究湖南省重點實驗室；3 中南大學醫(yī)學遺傳學國家重點實驗室

2006年的第二次全國殘疾人抽樣調查結果顯示，我國現有聽力殘疾患者2 780萬人。嚴重的耳聾可以導致聾啞殘疾從而使患者喪失正常的社會交流能力，給其生活和工作帶來極大的障礙。統(tǒng)計顯示，在美國人群中新生兒先天性聾約占1‰[1]，大多數語前聾患者與遺傳因素有關[2]。根據患者是否伴隨其他癥狀或體征，遺傳性聾可分為綜合征型聾和非綜合征型聾；根據遺傳方式的不同又可以分為常染色體隱性遺傳、常染色體顯性遺傳、伴性連鎖性遺傳及線粒體母系遺傳等。其中常染色體顯性遺傳占遺傳性聾的15%左右，到目前為止，已經成功克隆了24個常染色體顯性遺傳相關基因。本研究對一個遲發(fā)性非綜合征型常染色體顯性遺傳性聾家系的遺傳學特征進行了詳細分析，并對其進行了初步的基因突變篩查，報告如下。

1 資料與方法

1.1 病史及標本采集 該家系的先證者于2011年3月就診于中南大學湘雅醫(yī)院耳鼻咽喉科門診。對參與研究的各家系成員充分告知相關事項，簽署知情同意書。采用問卷調查的方法詳細記錄受試者的病史資料，包括患者的一般信息、耳聾史、家族史、既往史(曾經的疾病史、用藥史、噪聲接觸史、手術外傷史等)、體格檢查、聽力學檢查及相關特殊檢查情況。為排除耳部器質性病變，對先證者(IV:22)和另外一名隨機抽取的患者(III:2)做了顳骨高分辨率CT掃描。納入研究的家系成員均抽取外周靜脈血5毫升(采血管含EDTAK2抗凝劑)，用于基因組DNA的提取。

1.2 基因組DNA的提取 對采集到的外周靜脈抗凝血用標準的酚-氯仿法提取基因組DNA(gDNA)，1×TE緩沖液溶解DNA后取出2 μl以NanoDrop 1 000(v 3.7.1)分光光度計(Thermo Scientific Co., DE, USA)檢測濃度，并根據A260/A280的吸光度比值判斷gDNA的純度，得到的gDNA樣品A260/A280的比值均在1.8～2.0之間。根據所測濃度，用1×TE緩沖液稀釋gDNA樣品至工作濃度50 ng/μl，分裝-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 候選致病基因的篩查 經查閱相關文獻[3]，選取臨床表型相似且較常見的常染色體顯性遺傳性聾(DFNA)致病基因GJB2 (NM_004004.5)、GJB3(NM_024009.2)、 KCNQ4 (NM_004700.3)、COCH (NM_004086.2)和EYA4 (NM_004100.4)作為候選致病基因。

在美國國家生物技術信息中心的Genbank數據庫(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/)中查閱以上候選基因標準序列后使用加拿大生物研究所提供的primer3在線引物設計軟件(http://frodo.wi.mit.edu/primer3/)設計引物，設計的引物確保PCR擴增產物涵蓋所有外顯子編碼區(qū)及側翼內含子序列，所有引物均由上海生工生物技術有限公司合成。

以先證者外周血為模板進行PCR擴增，PCR反應體系為：Premix Ex Taq (Hot Start Version) 10 μl(寶生物工程有公司)，基因組DNA 2 μl(50 ng/μl)，正反向引物各1 μl(50 ng/μl)，補三蒸水至20 μl。反應條件為：94 ℃預變性1 min，98 ℃變性10 sec，65 ℃退火30 sec，72 ℃延伸1 min，以后每2個循環(huán)降低2 ℃直到降至57 ℃，共10個循環(huán)，把55 ℃作為“touchdown”退火溫度，98 ℃變性10 sec，55 ℃退火30 sec，72 ℃延伸1 min，共20個循環(huán)，最后充分延伸10 min，4 ℃保存。使用的儀器為PE9600 PCR儀(Perkin Elmer公司)。PCR產物經蝦堿性磷酸酶和限制性核酸外切酶酶切純化，純化后的PCR產物用聚丙烯酰胺凝膠電泳驗證其特異性，符合要求的樣本使用ABI 3730測序儀直接雙向測序，測序結果使用DNASTAR-Lasergene SeqMan Pro軟件與GeneBank數據庫中查得的序列進行序列比對。

2 結果

本家系所有成員均為湖南籍，漢族。調查的78人中22人發(fā)病(其中6人已故)，年齡最小的患者為9歲(V:13)，大部分患者臨床表現基本一致，主訴大約在9～25歲時覺雙耳“嗡嗡樣”耳鳴，隨后出現聽力下降，聽力下降的程度逐漸加重，無耳溢、眩暈等。除耳聾家族史外無其它家族性疾病，無明確的氨基糖苷類抗生素等耳毒性藥物應用史，無長期噪聲接觸史，全身及耳鼻喉專科體格檢查無明顯異常發(fā)現。純音測聽示早期以高頻聽力下降為主的感音神經性聾，隨著發(fā)病時間的延長，慢慢發(fā)展為全頻下降的重度或者極重度感音神經性聾(判斷標準依據WHO1997年公布的聽力損失程度分級標準)，部分患者的聽力圖見圖1。先證者和另外隨機抽取的一名患者的顳骨高分辨CT檢查示內耳及中耳均無明顯器質性病變(圖2)。根據受試者的一般信息及檢查結果，用Cyrillic軟件(2.02 Version)繪制了家系圖(圖3)。

該家系連續(xù)5代發(fā)病，男女發(fā)病比例8:14(女性患者較男性多是因為女性在第2代占總人數的絕大多數)，父母一方患病，其子女均可能受累，父母雙方均表現正常，子女也均表現為正常，男女發(fā)病者占總體性別的比率均等，符合常染色體顯性遺傳的特征。體格檢查及影像學未見患者伴隨其他疾病，可以認為該家族為非綜合征型聾。出生時均表現為正常，到一定年齡之后起病，這符合遲發(fā)性聽力損失的特征。

通過對家系成員外周血基因的直接測序結果與GeneBank數據庫中的序列進行比對，GJB2、GJB3、COCH和EYA4這4個基因均無異常發(fā)現，僅在KCNQ4基因中發(fā)現了3處雜合的堿基改變(圖4)，其中在第5和第14外顯子編碼區(qū)的兩個突變位點c.777 T>C(為已報道的單核苷酸多態(tài)性位點rs:4660468)和 c.1986 C>G(未見報道)均為同義突變，沒有導致氨基酸的改變，IVS4+14G>C也是已經報道的單核苷酸多態(tài)性位點(rs:2361660)。對家系其他患者和正常人檢測這三個位點的突變情況，沒有發(fā)現這些堿基改變與臨床表型有共分離現象。

圖1 家系部分成員的純音測聽圖

圖2 家系成員IV:22(a)和III:2(b)的顳骨高分辨率CT圖像

□正常男性;○正常女性;■患者男性;●患者女性;先證者;/已故圖3 一個湖南籍非綜合征型常染色體顯性遺傳性聾大家系系譜圖

圖4 KCNQ4基因在該家系中的堿基改變情況

3 討論

非綜合征型遺傳性聾目前仍被視為單基因遺傳病，其致病原因往往是由于某個基因的堿基序列發(fā)生了改變。目前人們已經成功克隆出非綜合征型聾責任基因約60個，其中DFNA25個，常染色體隱性遺傳性聾基因(DFNB)39個，伴X連鎖遺傳性聾基因(DFNX)3個，其中GJB2、GJB6、MYO6、MYO7A、TECTA、TMC1、COL11A2這7個基因既可引起DFNA又可引起DFNB[4]，線粒體突變也是導致感音神經性聾的常見原因。目前認為GJB2(connexin-26，Cx26)是最常見的遺傳性聾致病基因，它既可以導致常染色體隱性遺傳性聾(DFNB1A)，也可以導致常染色體顯性遺傳性聾(DFNA3A)[5]。GJB2已有百余種突變方式被報道，其中9種突變方式可以導致常染色體顯性遺傳性聾，患者的聽力損失程度也從輕度到極重度不盡相同，遲發(fā)性者可表現為高頻聽力損失為主的下降型聽力曲線，往往呈進行性加重[6]。GJB3和KCNQ4同位于DFNA2座位上，前者最早由我國學者夏家輝院士克隆于中國的兩個耳聾家系中，家系成員中患者的聽力曲線呈下降型[7]；后者已在數個家系中發(fā)現突變，患者開始時多為高頻聽力損失，隨年齡增長逐漸累及全頻，聽力損失程度逐漸加重，發(fā)病年齡多在10～20歲之間[8,9]。COCH于1998年被鑒定為耳聾致病基因[10]，并在多個耳聾家系中發(fā)現存在突變，被報道的突變位點有12個，患者表現為20歲左右起病，耳聾進行性加重，直至全聾，但該基因導致的耳聾多伴隨前庭功能障礙癥狀[11,12]。2001年科學家們在兩個互不相干的遲發(fā)性常染色體顯性遺傳性語后聾家系中發(fā)現了EYA4基因缺陷，患者表現為高頻及中頻聽力損失[13]，隨后在其他的幾個家系中也發(fā)現了EYA4基因突變[14～16]，目前報道有6種突變方式。

與上述DFNA家系相似，文中家系成員中患者的臨床表型也表現為遲發(fā)性語后聾，由最初的高頻聽力下降發(fā)展為全頻聽力損失。但該家系又有自己的特點，表現為聽力損失之前先出現“嗡嗡樣”耳鳴，之后耳鳴伴隨聽力下降持續(xù)存在。家系成員之間表型的高度一致性說明他們之間存在共同的遺傳基礎，很可能是由于相同的遺傳學缺陷導致的。

本研究通過對候選致病基因的突變篩查，僅在先證者KCNQ4基因的第5和第14外顯子編碼區(qū)以及第4內含子剪接區(qū)發(fā)現了堿基序列的改變，其余基因序列的測序結果均與NCBI GeneBank數據庫中公布的序列一致。KCNQ4基因突變最先在一個法國家系中被鑒定為耳聾致病基因[17]，隨后在比利時、美國、荷蘭、日本等多個國家的耳聾大家系中被報道存在移碼、無義等形式的突變[18～21]。目前，共發(fā)現KCNQ4的耳聾相關突變位點16個，其中錯義突變13個，剪接位點突變1個，微小缺失2個。KCNQ4基因 位于人染色體1p34上，編碼一種K+通道蛋白，它對維持內耳功能及內環(huán)境的K+穩(wěn)態(tài)起著關鍵作用[22]。

本研究根據患者的表型推測，對有可能致病的幾個候選基因通過PCR擴增直接測序的方法初步進行耳聾致病基因突變篩查，結果僅發(fā)現家系中先證者KCNQ4基因編碼區(qū)的兩處堿基改變均為同義突變，剪接區(qū)的堿基改變也為已經報道的良性多態(tài)。同時對家系中其他患者進行突變檢測以后，發(fā)現這些堿基改變均沒有和疾病發(fā)生共分離，說明KCNQ4可能不是這個家系的致病基因。下一步將運用連鎖分析，必要時結合外顯子組測序的方法對該家系患者的致病原因進行進一步研究。

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