封閉環境對C57BL/6J小鼠聽功能及聽皮層GABA能神經元凋亡的影響*

吳曉平 陳繼川 陳煒

老年性聾主要的病理學變化是聽覺神經細胞的凋亡[1～3]，并且可能是外周聽覺系統與中樞聽覺系統功能聯合降低衰變的結果[4，5]，其病因可能為遺傳性因素與環境因素的共同作用，其中遺傳因素在老年性聾發展過程中所起作用的比例約為35%～55%[6]。有關后天環境因素與老年性聾的關系的研究集中于環境噪聲[7]、耳毒性藥物[8]、糖尿病[9]、心血管病[10]等等方面，而對環境因素的研究中注意到許多老年人處于相對封閉的社會生活環境下，這種情況對老年性聾的發生發展是否有促進作用目前未有明確報道。本實驗擬通過將老年性聾動物模型置于封閉環境中，探討封閉環境對老年性聾的影響。

1 材料與方法

1.1實驗動物及試劑 無強噪聲暴露史及耳毒性藥物使用史的2月齡(體重15～25 g)、10月齡(體重45～60 g)老年性聾動物模型C57BL/6J小鼠各40只，均為雌性，購于第三軍醫大學大坪醫院野戰外科研究所實驗動物中心，SPF級。鼠抗γ-氨基丁酸(GABA)多克隆抗體購于sigma公司，二抗兔抗鼠Dylight及Tunel試劑盒購于江蘇碧云天生物技術研究所,速眠新II購于長春軍事醫學科學院研究所。

1.2封閉環境的構建 自制約為0.30 m×0.30 m×0.30 m大小空間的鼠籠，透光透氣，互相遠離并置于安靜環境，使之不受外來噪聲影響。溫度控制在20～25℃，飲食光線等無特殊干預。除喂食水及清潔鼠籠外，盡量不干擾實驗動物。

1.3實驗方法

1.3.1動物分組及飼養 實驗動物群居飼養1月后分組，將2月齡、10月齡動物各均分為實驗組和對照組，每組20只。將實驗組動物全部單獨置于封閉環境中，對照組繼續普通環境群居飼養，各組動物分別飼養2個月。

1.3.2ABR檢測 實驗組與對照組動物分別于分組前及分組飼養2月后進行ABR檢測，動物均以左耳為測試耳。采用美國智聽公司(intelligent hearing system)Smart EP進行ABR檢測，動物以20%的速眠新II(10 ml/kg)肌肉注射麻醉，麻醉后置隔聲恒溫室內，自制電極連接，以鼻尖為地線，顱頂為記錄電極，左側乳突為參考電極，給聲管置于左側外耳道中，刺激聲為純音(puretoner)，低通1 500 Hz，高通100 Hz，疊加1 024次，刺激重復率11.1次/秒，刺激聲90 dB SPL,以10分貝遞減，閾值附近5分貝遞減，以可引出波III的最小刺激強度為閾值。分別檢測1、2、4、8、16 kHz各頻率反應閾。

1.3.3聽皮層神經元凋亡檢測 動物用20%的速眠新II(10 ml/kg)麻醉后，暴露心臟，剪開右心耳，同時經左心室快速灌注37 ℃ PBS 60～80 ml以沖盡血液，此后先快速灌注4 ℃的4%的多聚甲醛40 ml左右，再緩慢灌注40～60 ml，然后開顱取腦組織，置于上述灌注液中，4 ℃保存，24小時后修剪標本。聽皮層的定位參照The Mouse Brain in stereotaxic coordinates圖譜，取聽皮層組織，沿冠狀面常規方法制作冰凍切片，片厚10 μm ，切片間隔20 μm，每個標本取10張切片，隨機抽取5張，0.3% Triton，37 ℃，15 min，山羊血清封閉，37 ℃，30 min；加入一抗鼠抗GABA(濃度為1:400)，4 ℃孵育24 h；Dylight(濃度為1:100)37 ℃孵育1 h，在每兩個步驟中間都用PBS洗3遍，每遍5 min，此后按tunel說明書操作檢測凋亡情況。激光共聚焦顯微鏡觀察拍照，細胞核被染成紅色為凋亡的聽皮層細胞，胞漿呈藍色為聽皮層GABA能神經元，胞核呈紅色而胞漿呈藍色為聽皮層凋亡的GABA能神經元，任選5個聽皮層視野計數并取平均值。

1.4統計學方法 采用SPSS13.0統計軟件對資料進行數據分析,兩組均數比較用t檢驗(P<0.05有統計學意義)。

2 結果

2.1ABR檢測結果 不同年齡的實驗組各頻率ABR閾反應閾與對照組相比明顯提高，尤其以高頻(8、16 kHz)明顯(P<0.05或P<0.01)；2、10月齡實驗組各頻率反應閾明顯高于分組前(P<0.01)，而2月齡對照組在16 kHz、10月齡對照組在4、16 kHz的反應閾均較分組前升高(P<0.05)(表1)。

表1 各組ABR不同頻率反應閾比較

注：與同齡對照組比較，*P<0.05，**P<0.01；與同齡分組前比較，#P<0.05，##P<0.01

2.2各組聽皮層GABA能神經元凋亡數 2月齡實驗組的聽皮層GABA能神經元數與對照組無差異(P>0.05)，而凋亡的細胞數及凋亡的GABA能神經元數增多，與對照組比較差異有統計學意義(P<0.05)。10月齡實驗組GABA能神經元數明顯少于對照組(P<0.01)，而凋亡的聽皮層細胞個數明顯多于對照組(P<0.01),而由于10月齡實驗組GABA能神經元已大量凋亡，許多已不能被驗出，故殘存的凋亡GABA能神經元數偏少(圖1，表2)。

表2 各組GABA能神經元、凋亡的聽皮層細胞及凋亡的GABA能神經元數(個/視野，

注：與同月齡對照組比較，*P<0.05，**P<0.01

圖1 Tunel法檢測聽皮層GABA能神經元的凋亡(激光共聚焦顯微鏡 ×800)

3 討論

C57BL/6J小鼠是一種具有先天性遺傳缺陷的老化動物模型，具有與人類相似的聽覺衰退現象，故常被用于老年性聾的研究[11，12]，因此本研究選擇G57BL/6J小鼠來進行實驗以模擬人類社會生活環境尤其是封閉環境對老年性聾的影響。對老年性聾的外部環境研究發現不同年齡段的C57BL/6J小鼠聽力損失程度不同，性別的差異也影響聽力損失水平[13，14]；所以，本研究選擇了不同年齡階段的同性別的動物；而為了更好的模擬老年人生活環境的變化，先將所有實驗動物群居飼養了1個月后再分組分別予以封閉環境和普通環境飼養，結果顯示在置于封閉環境后，實驗組動物活動減少，對刺激的敏感性下降，ABR反應閾比對照組提高，并且呈現出與年齡呈正相關。

目前發現老年性聾患者聽覺功能衰退主要表現為言語區功能障礙，故認為中樞聽覺系統病變為主要病因。聽皮層中GABA能神經元含量豐富，本實驗的結果顯示聽皮層GABA能神經元凋亡程度越重，其聽功能受損程度越嚴重，說明聽皮層GABA能神經元凋亡是老年性聾的重要病理因素。

目前公認的影響老年性聾最為重要的環境因素是噪聲，此外，其發病率因地區環境、生活狀況、飲食習慣及性別因素而不同，且受地區差異及許多未知因素如文化習俗、飲食習慣、精神壓力及測試標準等影響，因而各時期各地區關于老年性聾發病率的報道各異。鄭宏等[15]于1997年報道老年聾無論城鄉均存在明顯的地區差異，且同一地區城鄉之間也存在差異；陳曦等[16]報道廣東省老年性聾發病率農村(73.3%)高于城市(26.7%)；劉民等[17]報道北京老年性聾發病率城市(48.23%)稍高于農村(41.63%)。這些流行病學資料間接說明患者所處的社會生活環境對老年性聾的重要影響。而現在存在普遍的社會現象是許多老年人由于疾病、喪偶、退休失業、子女外出工作等原因，其生活單調枯燥，缺乏正常的社交活動，對新事物的認知接受能力及意愿均減退，容易產生失落感和孤獨感等情緒，與其它人群相比，其社會生活空間狹小封閉，尤其是在一些偏僻農村地區。封閉環境對老年性聾的發生發展是否有影響，值得探討。從文中結果看，置于封閉環境后，實驗組動物與分組前及同齡對照組比較其聽皮層的GABA能神經元數目減少，凋亡程度增加，聽功能減退，尤其在8、16 kHz高頻區表現明顯(P<0.01)。而處于開放環境中的2月齡對照組動物與分組前聽功能比較，除在16 kHz反應閾升高外(P<0.05),其余頻率無明顯差異，而2月齡實驗組各頻率ABR反應閾均較同月齡對照組及分組前明顯升高；10月齡對照組與分組前相比，在4、16 kHz反應閾升高(P<0.05)，而實驗組各頻率ABR反應閾較同月齡對照組及分組前明顯升高，由此可證明封閉環境可導致聽皮層GABA能神經元凋亡，進而導致聽功能下降，并且對高頻聽功能影響明顯。另外，本研究經Tunel法檢測聽皮層細胞凋亡時發現，2、10月齡實驗組細胞凋亡數均高于對照組，說明封閉環境也能促進聽皮層除GABA能神經元以外的其它細胞的凋亡，而這種其它細胞的凋亡是否與聽功能下降有關，除了GABA能神經元外還有哪些細胞與聽功能關系密切，它們與GABA能神經元對聽功能的影響是拮抗作用還是協同作用等等，都有待于進一步研究。

老年性聾作為一種神經功能退行性病變，其病因非常復雜，本研究為排除其他影響因素干擾，以同樣時間、地區、相同的年齡、同樣的飲食、同樣的測試標準單純考查封閉環境對老年性聾發生發展的影響，結果證實GABA能神經元凋亡是老年性聾的病理變化；封閉環境是老年性聾的危險因素，它能促進聽皮層GABA能神經細胞的凋亡，從而加快老年性聾的發生和發展。而封閉環境通過何種機制導致GABA能細胞凋亡，有待于進一步研究。

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