噪聲對豚鼠耳蝸血管紋緊密連接蛋白claudin-5表達及血迷路屏障通透性的影響△

吳永翔 朱國霞# 劉新秦 米文娟 劉順利 盧連軍

研究表明噪聲可以引起血迷路屏障的改變，從而造成耳蝸內環(huán)境改變(如內耳內外淋巴液滲透壓、離子濃度或/和代謝機制失衡)，這與噪聲導致聽力損失的機制有關[1]。而血迷路屏障(blood-labyrinth barrier,BLB)是存在于血液和內耳迷路之間的具有選擇通透性的一種生理屏障系統(tǒng)，其作用在于保持迷路成分的相對穩(wěn)定，維持內耳微環(huán)境的平衡，從而保證內耳功能的正常[2，3]，它主要由耳蝸外側壁血管紋、螺旋韌帶處連續(xù)無窗的毛細血管內皮細胞,邊緣細胞之間和基底細胞之間的致密閉鎖帶以及蝸軸細胞間的緊密連接復合體構成[4]。而血管紋毛細血管是血迷路屏障重要的形態(tài)學基礎，其血管內皮細胞接觸面近管腔側和邊緣細胞之間均為緊密連接(tight junction,TJ),此外微血管的周細胞也通過緊密連接包繞血管內皮細胞[5]。

緊密連接結構中的核心部分是TJ相關蛋白，它包括咬合蛋白occludin、閉合蛋白claudins、連接粘附分子(junctional adhesion moleculos,JAM)，以及閉合小環(huán)蛋白(ZO-1等)，其中閉合蛋白claudins家族可以與其它連接蛋白形成致密的緊密連接復合體，從而保證血迷路屏障的結構與功能，其表達具有組織特異性，大多數組織表達多種claudins[6]。有研究指出claudin-5在內耳血管紋邊緣細胞和基底細胞之間表達均為陰性[7]，但其微血管內皮細胞之間是否存在claudin-5表達卻鮮有報道。

本文擬觀察噪聲對豚鼠BLB中TJ及緊密連接蛋白claudin-5表達的影響，以期為臨床噪聲性聾的治療提供理論依據。

1 材料與方法

1.1實驗動物分組及噪聲性聾模型的建立 40只健康成年雄性白化豚鼠，體重250～350 g, 耳廓反射靈敏，鼓膜完好(由第四軍醫(yī)大學實驗動物中心提供)，隨機分為正常對照組(20只)和噪聲暴露組(20只)，正常對照組不予噪聲暴露，噪聲暴露組給予聲強為115 dB SPL白噪聲暴露，每天6小時，連續(xù)兩天，噪聲暴露期間，豚鼠均能自由活動和飲食飲水，與正常對照組豚鼠無異。

1.2實驗方法

1.2.1聽性腦干反應(ABR)檢測 將各組豚鼠置于屏蔽隔聲室內，用ABR檢測儀(Bio-logic Systems，美國)檢測雙耳反應閾值。豚鼠腹腔注射2%戊巴比妥鈉鹽40 mg/kg麻醉，記錄電極置于顱頂正中皮下，參考電極置于測試耳耳后皮下，接地電極置于鼻尖。采用click聲刺激，頻率13次/秒，由TDH49耳機輸出，掃描時間為10 ms，濾波范圍100～3 000 Hz，疊加256次，以波Ⅲ為標準判斷反應閾。檢測過程中保持豚鼠體溫恒定。各組于實驗前、噪聲暴露后次日行ABR檢測，檢測完后進行后續(xù)實驗。

1.2.2基底膜鋪片FITC鬼筆環(huán)肽染色 每組豚鼠各取2只，快速斷頭取雙側聽泡，圓窗、蝸尖刺開，4%多聚甲醛體外灌流，同樣固定液固定2小時后，于體視顯微鏡下行基底膜全層剝離；將標本放入1%正常胎牛血清白蛋白封閉30分鐘，FITC鬼筆環(huán)肽(Enzo，德國，1：50)孵育30分鐘(避光)，再用0.01 M PBS漂洗，鋪片、甘油封片，顯微鏡(OLYMPUS BX-5,日本)下觀察并照相。于基底膜底回三排外毛細胞處放大400倍，連續(xù)抽取5個視野進行外毛細胞計數并測量該視野下外毛細胞所占基底膜的面積，計算出單位面積外毛細胞數(外毛細胞數/外毛細胞所占基底膜面積)并進行統(tǒng)計學分析，如視野周邊出現不完整的細胞則只記一邊。

1.2.3硝酸鑭透射電鏡和常規(guī)透射電鏡標本制備與觀察 每組豚鼠各取2只，用新鮮配制好的硝酸鑭-二甲胂酸鈉固定液體內灌注充分后(目的在于檢測血迷路屏障通透性)，斷頭取雙耳聽泡。置入固定液后于4 ℃冰箱保存至少24小時，常規(guī)透射電鏡標本則用2.5%戊二醛經蝸尖和圓窗膜體外灌流固定液固定2小時；固定好的標本經洗液漂洗4小時，于體視顯微鏡下取出耳蝸血管紋后，用1%鋨酸固定2小時，梯度丙酮脫水，按照每回上半回、下半回的順序放入平板中Epon812定向包埋。制作半薄切片、染色、定位后，超薄切片、鈾染、鉛染、滴網后，透射電鏡觀察。

1.2.4Western blot 檢測 各組豚鼠取12只迅速斷頭，分別取出雙側聽泡和眼球，于體視顯微鏡下迅速取出耳蝸外側壁血管紋和視網膜后，將組織凍存于-80 ℃冰箱待測，整個取材過程均置于冰上或冰水中操作。

提取組織蛋白前，先將凍存于-80℃冰箱的兩組血管紋和視網膜組織標本稱重后，分別放入標記好的勻漿器中，加入事先配好的組織裂解液，冰上充分勻漿，12 000 rpm，4 ℃，離心10分鐘，收集上清液后，所得即為制備好的蛋白樣品。吸取少量的蛋白樣品，按1：20稀釋成工作液后，用BCA法進行蛋白定量。按每個泳道5 μg加載于SDS-PAGE凝膠電泳孔中，用恒壓120 V/40 mA電泳至溴酚藍位于凝膠底邊，再用恒流300 mA轉印于NC膜上。麗春紅染色，TBST緩沖液配置的50 g/L脫脂奶粉室溫下封閉2小時，然后加入兔抗豚鼠claudin-5一抗及兔抗GAPDH(Santa Cruz,美國，1：200)，4 ℃過夜，TBST緩沖液洗膜2次，每次10分鐘，再用TBS緩沖液洗膜1次，10分鐘，加入HRP標記的二抗(Invitrogen，美國，1：5 000 )，37 ℃孵育1小時，洗膜3次，每次10分鐘；然后ECL化學發(fā)光系統(tǒng)檢測claudin-5及GAPDH的蛋白表達水平。用蛋白marker分析陽性條帶的分子量大小，并用TANON高清晰度計算機圖像分析系統(tǒng)進行灰度掃描分析，檢測分析目的蛋白的表達量。其中視網膜組織為陽性對照，claudin-5抗體可識別相應的蛋白，GAPDH作為內參，分別于Mr 24KD和36KD出現陽性條帶，灰度掃描軟件系統(tǒng)分析。

1.2.5免疫組織化學染色 每組各取2只豚鼠，用新鮮配制的4%多聚甲醛體內灌注充分后，斷頭取雙側聽泡。再刺開蝸尖和圓窗膜，用4%多聚甲醛分別從蝸尖和圓窗膜灌流數次，置入固定液后于4 ℃冰箱保存至少24小時；10%EDTA脫鈣兩周，置于30%蔗糖浸泡24小時；OCT膠包埋，平行蝸軸以10 μm為厚度連續(xù)冰凍切片后，室溫過夜晾干。切片先用0.01 M PBS洗片數次，再用0 .3%甲醇雙氧水浸泡放置于37 ℃濕盒，10分鐘，滅活內源性過氧化物酶，用0.01 M PBS洗片，滴加羊血清抗體封閉液(Jackson Immunoresearch Lab, 美國)37 ℃封閉30分鐘；然后滴加一抗兔抗豚鼠多克隆抗體(Santa Cruz,美國，1：200)；正常組和噪聲暴露組分別設陰性對照組，陰性對照組均加入0.01 M PBS 替代一抗，4 ℃過夜。0.01 M PBS洗片數次，滴加生物素化羊抗兔IgG(即用型)，37 ℃孵育30分鐘；0.01 M PBS洗片后，滴加SABC，37 ℃，30分鐘；洗片后加入新鮮配制的0.05%DAB和0.03%雙氧水混合液顯色2～5分鐘，蒸餾水終止，0.01 M PBS洗片；經蘇木素復染核后，乙醇梯度脫水，二甲苯透明，樹膠封片。待干燥后顯微鏡下觀察。

光鏡下，血管紋邊緣細胞層、基底細胞層、微血管內皮細胞間和管周，以及螺旋韌帶微血管處的棕黃色顆粒均為陽性著色。其染色結果采用灰密度分析法，通過在不同組別的組織切片上選擇相同區(qū)域、相同條件下用Image J軟件進行光密度分析后，將所得數據進行統(tǒng)計分析。

1.3統(tǒng)計學方法 計量資料用均數±標準差表示，數據應用SPSS13.0統(tǒng)計軟件分析，采用兩獨立樣本t檢驗或One-way ANOVA方差分析進行統(tǒng)計學檢驗。

2 結果

2.1兩組豚鼠ABR反應閾 噪聲暴露組豚鼠噪聲暴露前后ABR波Ⅲ反應閾分別為17.08±2.52和61.88±10.41 dB SPL，其閾移超過40 dB，噪聲暴露前后ABR反應閾比較差異有顯著統(tǒng)計學意義(P<0.05)；正常對照組為19.17±2.82 dB SPL，噪聲暴露后兩組反應閾差異也有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，說明造模成功。

2.2兩組耳蝸基底膜FITC染色結果 正常對照組外毛細胞排列整齊，纖毛方向一致呈V或W型，而噪聲暴露組可見基底膜毛細胞大量缺失，纖毛排列紊亂，出現倒伏或融合消失(圖1)。正常組和噪聲暴露組基底膜底回單位面積外毛細胞數分別為(5.83±0.22)×103、(4.07±0.26)×103個/mm2，后者明顯少于前者(P<0.05)。

2.3透射電鏡觀察結果 常規(guī)透射電鏡觀察可見，噪聲暴露組噪聲暴露后血管紋結構紊亂，組織細胞有不同程度的變性水腫和壞死，微血管管腔變形，管壁基膜電子密度降低并出現復層化，腔內有大量膜性結構；同時，血管紋微血管內皮細胞之間和邊緣細胞之間的緊密連接均有破壞和松解，細胞間雙層結構消失，連接松散并間隙增大；而正常組血管紋結構正常(圖2)。

圖1 豚鼠基底膜鋪片FITC染色(Scale bar: 20 μm)

圖2 正常組和噪聲暴露組豚鼠耳蝸血管紋常規(guī)透射電鏡結果(箭頭所示處為細胞間緊密連接)

硝酸鑭透射電鏡下可見正常組鑭顆粒均局限于微血管管腔內，部分內皮細胞間向管腔面可見少量鑭顆粒但其均未穿過緊密連接；而噪聲暴露組鑭顆粒穿過受損的內皮細胞間緊密連接，大量沉積于微血管基膜的內外兩側和管腔外的中間細胞層(圖3)。

圖3 正常組和噪聲暴露組豚鼠耳蝸血管紋微血管硝酸鑭透射電鏡結果(箭頭所示處為鑭顆粒滲透沉積部位)

a: 正常組鑭顆粒大多位于微血管管腔內壁，未穿過內皮細胞間緊密連接；b: 噪聲暴露組大量鑭顆粒穿透受損的緊密連接，沉積于微血管基膜的兩側和微血管管腔外的中間細胞層

2.4兩組血管紋緊密連接蛋白claudin-5的表達

Western blot結果分析示：兩組血管紋中claudin-5均有較高表達，但噪聲暴露組表達水平較正常組明顯降低；而在陽性對照的視網膜中，兩組claudin-5的表達并無明顯不同(圖4)。

2.5兩組耳蝸免疫組織化學染色光鏡觀察結果

圖5 正常組和噪聲暴露組豚鼠耳蝸外側壁中claudin-5的免疫組織化學染色(SABC×400)(Scale bar:100 μm)

正常組耳蝸血管紋毛細血管內皮、邊緣細胞層、基底細胞層和螺旋韌帶毛細血管內皮均有較強的棕黃色陽性顆粒著色；而噪聲暴露組以上部位雖也有棕黃色顆粒著色，但染色深度較正常組明顯淺。經圖像采集分析系統(tǒng)軟件分析各組免疫組化染色光密度值，結果示噪聲組的光密度值[(23.50±0.74)×10-3]較正常組[(74.10±7.04)×10-3]明顯下降，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。兩組陰性對照的耳蝸外側壁處均未發(fā)現免疫信號(圖5)。

3 討論

噪聲性聾的發(fā)生可能與機械損傷、氧化還原狀態(tài)失衡、氧自由基損傷、微循環(huán)障礙、鈣鎂離子平衡失調、谷氨酸興奮性中毒、毛細胞凋亡等因素有關[8.9]。耳蝸微血管內皮細胞的通透性正常對于維持內耳微環(huán)境的穩(wěn)定極其重要，這對BLB功能意義重大，它同時也是內耳內淋巴液保持高K+、低Na+的前提。研究表明血迷路屏障的破壞與噪聲性聾密切相關，耳蝸微血管內皮細胞通透性增高參與了噪聲所致的早期聽力損失[10]。本研究采用硝酸鑭透射電鏡和常規(guī)透射電鏡觀察，發(fā)現噪聲破壞了豚鼠耳蝸血管紋處的緊密連接，使細胞間隙增大；正常情況下位于微血管管腔內的鑭顆粒，通過受損的細胞間緊密連接，進入到微血管基膜內外兩側和中間細胞層中，表明噪聲通過破壞細胞間的緊密連接，增加了BLB通透性。

正常耳蝸微血管內皮細胞間廣泛存在的緊密連接保證了BLB的高選擇通透性和內外淋巴液的正常循環(huán)，而緊密連接蛋白的高表達是內皮細胞間緊密連接結構和功能的基礎；其中claudins對于屏障功能的維持和通透性的調節(jié)起著尤為突出的作用，它可以通過不同的信號通路，使自身蛋白發(fā)生磷酸化、去磷酸化或下調自身蛋白表達來實現調節(jié)屏障通透性的作用。claudins蛋白家族由24個跨膜蛋白亞型組成，分子量為20～27 kD,表達具有組織特異性，不同的claudin蛋白之間、claudin與occludin之間均能形成緊密連接復合物，從而發(fā)揮其功能[11～13]。claudin-5是緊密連接蛋白claudins家族中的一員，廣泛存在于各種組織屏障中，它對緊密連接微環(huán)境極其敏感，并可通過與其它緊密連接蛋白相互作用，改變屏障的通透性。claudin-5在腦微血管循環(huán)內皮系統(tǒng)中表達豐富。研究認為claudin-5是腦血管內皮細胞通透性的最重要的調節(jié)因子，對血腦屏障通透性可能起著至關重要的調節(jié)作用[14，15]。大鼠腦缺血后，其血腦屏障可出現基質金屬蛋白酶介導的緊密連接蛋白claudin-5下調[16]。

本研究通過Western blot染色分析，發(fā)現正常豚鼠耳蝸血管紋緊密連接蛋白claudin-5與視網膜相比有較高的表達，同時發(fā)現噪聲可以下調其表達。免疫組織化學染色結果顯示，正常豚鼠耳蝸外側壁血管紋毛細血管內皮細胞、邊緣細胞、基底細胞和螺旋韌帶毛細血管內皮細胞處claudin-5免疫反應強陽性，噪聲可以導致豚鼠耳蝸外側壁血管紋上述細胞claudin-5免疫反應降低。進一步證實噪聲負性調節(jié)了緊密連接蛋白claudin-5的表達。

因此，推測噪聲可能激活了某些未知的細胞信號轉導通路，致使緊密連接蛋白表達下調，導致細胞間的緊密連接破壞，進而引起血迷路屏障通透性增加，誘發(fā)一系列的病理性損害，如內耳內外淋巴液滲透壓、離子濃度改變、代謝機制失衡等，從而導致噪聲性聽力損失。本研究結果提示緊密連接蛋白claudin-5的表達下調可能在噪聲所致的BLB通透性改變中發(fā)揮一定作用，但其確切作用還有待于進一步的研究。

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