犬聲帶激光損傷模型的建立及意義*

韓鵬 梁媛媛 趙昱 劉陽 楊潤琴 鄧志宏

聲帶是發聲的主要器官，其固有層的組織結構是正常發聲的基礎。手術、外傷、慢性炎癥均有可能導致聲帶固有層損傷，造成細胞外基質成分的正常結構破壞，大量纖維組織增生、排列紊亂，從而產生瘢痕導致發聲障礙。目前用于治療聲帶損傷的方法主要為聲帶注射術，通過注射生物材料作為填充物，以減少聲帶瘢痕的形成，而術后對瘢痕愈合過程的觀察多限于大體形態觀察，包括損傷處局部有無充血、水腫、萎縮及瘢痕形成等。對聲帶細胞外基質成分的變化缺乏敏感指標，聲帶固有層細胞外基質(ECM)成分主要包括膠原纖維、彈力纖維、透明質酸和纖維連接蛋白(fibronectin)。膠原纖維起ECM的支架作用，聲帶損傷后其含量增加，呈粗而排列紊亂的纖維束；彈力纖維可以維持組織的彈力，損傷后其含量下降，排列紊亂；透明質酸影響聲帶的粘彈力，損傷后含量持續下降；纖維連接蛋白則是纖維化過程的前驅物質，損傷后含量持續增加[1～5]。因此，這些成分的變化可以在組織水平反應聲帶固有層損傷后的修復情況。

為更好的觀察各種材料對聲帶損傷的修復作用，建立完善的聲帶損傷動物模型十分關鍵。目前常用的聲帶損傷動物模型有小鼠、大鼠、兔及犬模型等。因犬聲帶組織結構與人相近，是理想的實驗動物[6,7]。聲帶手術導致的損傷常見的有激光造成的熱損傷及手術器械造成的銳性損傷，半導體激光因其出血少等優點已廣泛應用于嗓音外科[8～11]。因此，本實驗選用犬為實驗動物，模擬臨床激光手術，在支撐喉鏡下用半導體激光損傷雙側聲帶，觀察術后聲帶愈合的大體形態及組織學變化，為下一步用干細胞修復聲帶損傷的實驗提供基礎。

1 材料與方法

1.1實驗動物 健康成年中華田園犬5只，體重10～15 kg，隨機編為1、2、3、4、5號犬，1號為對照組，2～5號為實驗組。實驗動物由第四軍醫大學實驗動物中心提供，實驗期間在第四軍醫大學西京醫院動物中心飼養。

1.2主要材料及器材 支撐喉鏡(定制)，半導體激光儀(Leica)，冷光源(Olympus)，0o內鏡(Stryker)，視頻記錄系統(Sony)，冰凍切片機(Leica)，抗Fibronectin抗體(1:100 abcam)，Masson三色染色、Elastin VG、愛先藍染色套裝(珠海貝索生物)。

1.3犬聲帶損傷模型建立方法 動物術前禁食12 小時，制動后稱重，經后肢肌肉注射速眠新0.1 mg/kg，戊巴比妥鈉0.2 mg/kg。麻醉后將動物固定于手術臺，將2～5號犬在支撐喉鏡下暴露雙側聲帶，局部噴少量利多卡因，半導體激光10 W點狀損傷雙側聲帶膜部中后1/3段，面積約8 mm2，深達甲杓肌。術后3 d連續肌肉注射慶大霉素2 ml/只。1號犬不作任何處理，作為對照組。

1.4大體形態學及組織學觀察 分別于術后4 d、2、4、8 w在支撐喉鏡下觀察聲帶創傷大體愈合情況后，各處死一只犬，于聲帶損傷處取材，一側聲帶冰凍切片行免疫組化Fibronectin染色，另一側石蠟切片行HE染色觀察聲帶的炎癥情況及Masson三色染色、Elastin VG染色、愛先藍染色分別觀察膠原、彈力纖維、透明質酸的變化。

1.5統計學方法 組織切片40倍顯微鏡下觀察聲帶固有層結構，100倍顯微鏡下通過PhotoshopCS3軟件對固有層細胞外基質成分進行全層量化數據分析，計算各個時間點聲帶固有層中膠原、彈力纖維、透明質酸及纖維連接蛋白的面積同固有層面積的百分比，每側任意選3張切片行計量分析。

2 結果

2.1術后犬聲帶大體形態變化 術后動物均健康存活，支撐喉鏡下見正常聲帶表面呈白色，粘膜光滑。術后4 d(2號犬)雙側聲帶充血、水腫，處于急性炎癥期；術后2 w(3號犬)雙側聲帶充血水腫減輕，表面覆有偽膜；4 w(4號犬)時損傷部位基本愈合，表面不規則且瘢痕形成，無明顯水腫或萎縮；8 w(5號犬)時可見聲帶瘢痕，損傷局部萎縮(圖1)。

2.2組織學變化

2.2.1HE染色結果 正常聲帶表面被覆復層扁平上皮，下為結締組織構成的固有層，主要含有膠原纖維、彈力纖維、纖維連接蛋白及透明質酸。術后4 d，雙側聲帶損傷處未被上皮覆蓋，局部大量炎性細胞浸潤及血管形成；術后2 w受損部位已被上皮完全覆蓋，炎性細胞較前減少；4 w時受損聲帶固有層被致密的纖維組織所替代，大量纖維組織無序排列；8 w時纖維組織有所增粗，排列紊亂，但局部無明顯炎性細胞浸潤。由于炎癥反應，術后2 w開始固有層出現大量腺體增生，至8 w時腺體未減少(圖2a～e)。

圖1 支撐喉鏡下所見正常、激光損傷即刻、損傷后各觀察時間點犬聲帶形態

圖2 聲帶組織HE染色及Masson三色染色圖片

圖3 聲帶組織EVG及愛先藍染色圖片

圖4 免疫組化DAB顯色圖片(×100)

2.2.2特殊染色及免疫組化觀察固有層ECM變化 Masson三色染色示膠原在正常聲帶內主要分布在固有層深層；2 w時膠原含量持續增加，膠原間夾雜大量腺體；4 w時膠原纖維呈條索狀，排列紊亂，含量持續增加；8 w時膠原呈粗大條索狀，分布紊亂，含量增加(圖2f～i)。EVG染色示正常犬聲帶內彈力纖維主要分布在固有層中層；術后2 w時其含量減少，排列紊亂；4 w時含量持續降低，纖維束較細；8 w時含量趨于穩定，排列略顯紊亂(圖3a～d )。愛先藍染色示透明質酸在正常聲帶內分布于固有層全層，術后2 w時含量降低，隨后含量持續下降(圖3e～h)。

免疫組化染色示纖維連接蛋白在正常犬聲帶內位于固有層全層，淺層含量略多。損傷后2 w至4 w，其含量持續增加，損傷后8 w時，含量略有上升(圖4a～d )。損傷后各組動物聲帶固有層細胞外基質成分含量的變化見表1。因術后4 d時聲帶充血水腫明顯，膠原纖維與肌組織結構混亂，各種ECM成分含量不易檢測，故表1中無術后4 d的數據。

3 討論

研究聲帶損傷的修復需要相應的聲帶損傷動物模型，既往有學者選用小鼠、大鼠、兔及犬模型等[12～15]，由于不同種屬動物組織結構不同，獲得的實驗數據差異較大，小鼠和大鼠雖易飼養和實驗操作，但其聲帶偏短不利于行聲帶注射術，且術后愈合情況不易觀察；兔的聲帶雖較長，但由于解剖原因兔聲帶不易暴露，手術多采用喉裂開方式，創傷較大；犬易飼養，其聲帶組織結構與人類相近，較適合作為實驗動物。因此，本實驗選用犬為研究對象，模擬臨床激光手術，建立了激光損傷犬雙側聲帶的動物模型。

表1 對照組及損傷后不同時間犬聲帶固有層中膠原、彈力纖維、透明質酸及纖維連接蛋白含量的變化(%)(n=1)

既往Tateya等[16]在內窺鏡下用顯微鑷將大鼠聲帶固有層剝離，術后2、4及8 w分別觀察聲帶固有層ECM的改變，結果顯示隨著時間的推移，術后聲帶中膠原纖維含量持續增加，透明質酸含量持續下降，纖維連接蛋白含量持續上升。Rousseau等[17]在內窺鏡下用顯微剪將犬聲帶固有層與肌層銳性分離，分別于術后2、6月時觀察聲帶內膠原纖維、彈力纖維、透明質酸、纖維連接蛋白的含量，結果示術后2月時聲帶固有層膠原含量上升，彈力纖維含量下降，膠原纖維及透明質酸含量與對照組無明顯差別，術后6月時膠原含量上升，彈力纖維含量下降，透明質酸含量與對照組無顯著性差異。本研究結果顯示，激光損傷犬聲帶后4 d時，聲帶表面充血水腫，膠原纖維與肌組織結構混亂，各種ECM成分不易檢測，術后2 w時膠原纖維增生，固有層細胞合成大量ECM成分修復缺損，術后4～8 w時膠原含量增加，纖維連接蛋白含量略上升，此期瘢痕組織漸趨于成熟，與上述學者的研究結果基本相符。說明半導體激光損傷聲帶的效果與使用顯微剪、顯微鑷損傷固有層的效果無明顯差別，提示半導體激光熱損傷是一種可行的建立聲帶損傷動物模型的方式。

綜上所述，支撐喉鏡下應用半導體激光造成犬聲帶膜部熱損傷，損傷后聲帶固有層內大量纖維組織形成，膠原含量上升，彈力纖維含量降低，透明質酸含量降低，纖維連接蛋白含量上升，為研究聲帶損傷的修復提供了可靠的動物模型。

4 參考文獻

1 Hirano S. Current treatment of vocal fold scarring[J]. Curr Opin Otolaryngol Head Neck Surg, 2005,13: 143.

2 Hansen J, Thibeault S. Current understanding and review of the literature: vocal fold scarring[J]. J Vioce,2006,20:110.

3 Hirano S, Minamiguchi S, Yamashita M. Histologic characterization of human scarred vocal folds[J]. J Voice, 2009, 23:399.

4 Ichiro T, Tomoko T, Diane B, et al. Cell production in injured vocal fold: a rat stady[J]. Ann Otol Rhinol Laryngol, 2006, 115:135.

5 Gray SD, Titze IR, Alipour F. Biomechanical and histologic observations of vocal fold fibrous proteins[J]. Ann Otol Rhinol Laryngol, 2000, 109:77.

6 Kanemanl S, NakamruaT, Omori L, et al .Regeneration of the vocal fold using autologous mesenchymal stem cells[J]. Ann Otol Rhinol Laryngol, 2003,112:915.

7 Byung G, Soo GW, Jin SJ, et al.The prevention of vocal fold scarring using autologous adipose tissue-derived stomal cells[J]. Cells Tissues Organs, 2006,184:198.

8 Sittel C, Eckel H, Eschenburg C. Phonatory results after laser surgery for glottic carcinoma[J]. Otolaryngol Head Neck Surg, 1998,119:418.

9 Yan Y, Olszewski A, Jiang J. Use of lasers in laryngeal surgery[J]. J Voice, 2010,24:102.

10 Benninger S. Laser surgery for nodules and other benign laryngeal lesions[J]. Curr Opin Otolaryngol Head Neck Surg. 2009,17:440.

11 Remijn E, Marres A, Hoogen J. Endoscopic laser treatment in pre-malignant and malignant vocal fold epithelial lesions[J]. Laryngol Otol, 2002,116:1 019.

12 Kanemal L, Nakamura T, Yamashita M, et a1.Destiny of autologous bone marrow-derived stromal cells implanted in the vocal fold[J]. Ann Otol Rhinol Laryngol, 2005,114:907.

13 Hertegard S,Cedervall J,Svensson B,et al.Viscoelastic and histologic properties in scarred rabbit vocal folds after mesenchymal stem cell injection[J].Laryngoscope,2006,116:1 248.

14 Babak J, Dinesh C, Ming Y,et al. Hylan B Gel Restores Structure and Function to Laser-Ablated Canine Vocal Folds[J]. Ann Otol Rhinol Laryngol,2008,117:703.

15 Halum SL, Naidu M, Delo DM, Autologous musclestem cells for the treatment of vocal fold paralysis:pilot study[J]. Laryngoscope, 2007, 117:917.

16 Tateya T, Tateya I, Sohn JH. Histological study of acute vocal fold injury in a rat model[J]. Ann Otol Rhinol Laryngol,2006,115:285.

17 Rousseau B,Hirano S,Scheidt T,Characterization of vocal fold scarring in a canine model[J]. Laryngoscope, 2003,113: 620.