自體脂肪及筋膜植入犬聲門旁間隙及固有層的實驗研究*

胡慧英 徐文 范爾鐘 張麗

繼發于單側聲帶麻痹、聲帶溝、聲帶萎縮、聲帶瘢痕等原因的聲門閉合不良，可引發明顯的發聲及吞咽障礙，嚴重影響患者的生活質量。聲帶填充術已廣泛應用于聲門閉合不良患者的治療，但是填充物的選擇仍然存在爭議。既往研究[1,2]采用脂肪、明膠海綿等大顆粒物質植入聲門旁間隙，但植入物存活時間有差異，而是否會影響手術效果也有分歧。本研究通過建立聲帶麻痹動物模型，研究自體脂肪、筋膜移植入聲帶后的局部病理反應，探討填充物作用機制及影響填充效果的因素，以期指導臨床應用。

1 材料與方法

1.1實驗動物與分組 選擇叫聲響亮的健康雜種實驗用犬(普通級)16只(因術中操作失敗及喉部嚴重感染死亡4只，未計入)，雌雄不限，年齡1.5～2.0歲，體重10.7～12.5 kg。實驗前經0°鼻內鏡檢查，犬喉部形態及聲帶運動均正常。16只犬的32側聲帶，除正常對照組2側聲帶不做任何手術處理外，其余30側聲帶在建立聲帶麻痹動物模型后，按照不同的植入材料、植入方式、植入部位和植入后觀察時間進行分組(表1)。

表1 實驗用聲帶分組(側)

1.2聲帶麻痹動物模型制備 除正常對照組聲帶外，其余實驗用犬以速眠新II注射液(0.15～0.2 ml/kg)麻醉，控制麻醉深度在III期1級，頸部正中切口，于第3、4氣管環平面用手術刀片截除喉返神經1.0 cm，斷端局部筋膜包埋，縫合切口，觀察1周后進行后續手術。

1.3自體填充物質獲取 切開犬腹部獲取脂肪，去除周圍組織后備用，自體筋膜組織取自犬腹直肌筋膜，剪成約1 mm×1 mm的小碎塊放入1 ml注射器中備用，或約5 mm長以濕紗布包裹備用。

1.4全麻下聲帶填充物植入

1.4.1聲門旁間隙脂肪注射 支撐喉鏡下，在鼻內鏡系統監視下應用Brunning高壓注射器將脂肪注入聲門旁間隙，注射量為0.5～1 ml。

1.4.2聲門旁間隙脂肪填充 頸部正中切口，暴露甲狀軟骨，正中裂開，徹底止血，在聲帶上表面與喉室交界處、聲帶外側切口，約1 ml脂肪塊完全植入聲門旁間隙，關閉甲狀軟骨，縫合切口。

1.4.3聲門旁間隙筋膜注射 用上頜竇穿刺針在甲狀軟骨板前下1/3處進針,插入聲門旁間隙,緩慢注入筋膜0.5～1 ml,直至聲帶邊緣凸起為止。

1.4.4聲帶固有層筋膜填充 支撐喉鏡下，在顯微鏡下應用喉部顯微手術器械切開聲帶表面黏膜，將條狀筋膜填充于聲帶黏膜下，以8-0絲線縫合黏膜切口。

所有實驗犬術后注射廣譜抗生素1周，流食3日后正常飼養。

1.5組織病理學觀察 于術后第1周、1、3、6、12個月用0°鼻內鏡觀察喉部形態及運動后，完整切取犬喉，常規石碏包埋。沿犬喉冠狀面自前聯合至聲帶突全喉切片,進行HE染色及Masson染色。高倍光學顯微鏡下觀察填充的脂肪和筋膜的生長特性，如填充物的存在狀態、吸收情況、異物反應等。40倍光學顯微鏡下獲得清晰的病理切片圖像，以Adobe Photoshop CS2軟件在1 024×768分辨率及25%縮放比例下進行圖像的量化分析(每側標本選取有觀察部位的全部切片，觀察部位的數據取均值)，分別計算單位面積(cm2)炎性細胞、纖維母細胞及新生血管個數、膠原纖維面積占圖像面積的百分比，以標尺工具計算填充物周圍纖維包膜厚度。

1.6統計學分析 所有數據由計算機統一收集，采用SPSS13.0統計軟件，組間比較用獨立樣本的t檢驗及方差分析或非參數檢驗。

2 結果

2.1內窺鏡下犬聲帶大體形態 自體脂肪與筋膜植入術后1個月內，70.0%(21/30)術側聲帶出現充血、水腫，均于術后3個月內消失，其中筋膜注射組反應出現比例最低(1/8)(圖1、2)。

自體脂肪或筋膜植入后第1周均可見術側聲帶體積飽滿，呼氣期末可內收超越中線，聲門閉合良好。術后第3個月，術側聲帶體積明顯縮小。填充物剩余體積觀察：筋膜注射組>脂肪注射組>脂肪填充組。術后第6個月時80%的聲帶可見植入部位隆起，體積趨于穩定。筋膜填充組術后觀察期內均可見填充部位隆起(因體積較小未測量)。

2.2實驗側聲帶光鏡觀察結果 自體脂肪、筋膜植入聲帶后，可見植入物與周圍正常聲帶組織間有較明確的界限。脂肪植入部位可見成活的團狀脂肪細胞存在，其間夾雜部分破碎的脂肪大泡；筋膜組織以密度較高的膠原纖維形式存在。植入部位組織病理學表現主要為：炎性浸潤、纖維形成(主要是Ⅰ型膠原纖維，呈不規則束狀，分布較均勻)、纖維母細胞形成、新生血管形成及纖維包膜形成(圖3～5)。病理變化依填充物、填充方式和觀察時間而不同。

圖1 左聲帶脂肪注射后1周纖維喉鏡圖像 左聲帶飽滿，內移，聲門閉合好圖2 左聲帶筋膜填充表面絲線縫合圖3 脂肪注射后6月聲帶光鏡觀察圖 可見纖維包膜及脂肪細胞存活(HE×40)圖4 筋膜注射后1月聲帶光鏡觀察圖 纖維均勻，纖維包膜形成(Masson×40)圖5 筋膜填充后3月聲帶光鏡觀察圖 纖維排列，無明顯包膜(HE×100)

脂肪植入組1周時有炎性反應，脂肪內新生血管形成出現于術后3月，同時填充物周圍組織形成少量纖維結締組織分隔脂肪填充物，即形成纖維包膜，3月時包膜厚度最大，與周圍組織分界清楚。6月后纖維母細胞出現，12個月時脂肪填充物仍然存在，填充物周圍組織未見壞死及萎縮。

筋膜注射組病理學表現主要是膠原纖維形成，呈束狀排列不規則，分布較均勻，隨時間推移密度無明顯變化。術后1月植入部位有纖維母細胞，同時纖維包膜形成，術后3個月時包膜厚度值最大，與周圍組織分界清楚，術后12個月時纖維包膜消失。術后12個月時筋膜注射部位始有新生血管形成。

筋膜填充組膠原纖維密度隨時間推移逐漸降低，在術后第1、3個月時膠原纖維密度最大，筋膜植入部位于第1個月時觀察到纖維母細胞，都以橢圓形纖維母細胞為主，3個月后筋膜組織呈漩渦狀排列，6個月后橢圓形纖維母細胞密度增大，填充部位有新生血管形成。纖維包膜厚度較低，6個月后消失。第12個月時其密度與周圍組織趨于一致，筋膜植入部位纖維排列較密，與聲帶固有層組織無明顯分界。

脂肪注射組觀察期內除2側聲帶分別于術后1、3個月時病理切片未發現填充物外，其余8側聲帶與脂肪填充組在各觀察時間點上形態學表現基本一致，組織病理學表現差異無統計學意義，因此合并為脂肪植入組進行分析(表2、3)(其中表2為所有觀察時間點數據的均值)。從表3可見，脂肪植入組纖維母細胞出現比例(4/15)小于筋膜植入組(9/15)，而新生血管形成比例(7/15)大于筋膜植入組(3/15)。

3 討論

聲帶填充術是將自體或異體生物材料注射或填充至聲帶不同層次或聲門旁間隙,使聲帶體積增加、游離緣內移,以改善聲門閉合狀況及聲帶振動特性，恢復發音及吞咽功能。目前對于聲帶麻痹及聲帶萎縮引起的聲門閉合不全，多用脂肪、明膠海綿等大顆粒物質填充，其粘彈性特性不影響聲帶振動。而聲帶溝位于聲帶固有層，在固有層內填充筋膜的同時，還要在聲門旁間隙注射脂肪[1，2]。

表2 各組術后聲帶組織切片光鏡下觀察結果

注：*與脂肪植入組比較，P<0.05;△與筋膜填充組比較，P<0.05

表3 各組各觀察時間點聲帶組織光鏡下病理變化出現側次(側)

脂肪與其他填充材料相比可以最大程度恢復聲帶振動特性，缺點是會被吸收。對于脂肪的吸收率有不同研究結果。Kruschewsky等[3]通過磁共振技術研究了犬單側聲帶麻痹后的脂肪吸收率，結果顯示在植入后3個月時脂肪注射吸收率為82%，Ⅰ型甲狀軟骨成型術脂肪填充吸收率為71%。徐文等[4]研究發現，注射脂肪后的第1個月吸收最為明顯，達30 %～35 %，術后18個月時患者發聲仍有明顯改善。溫武等[5]通過測量發現自體脂肪聲帶注射后12個月時聲帶體積仍有增大。本研究發現，脂肪注射填充物體積明顯減少出現于術后第1、3個月，但聲門閉合良好。有研究顯示，脂肪組織在術后第3個月時幾乎全部消失，由纖維母細胞和巨噬細胞代替[5，6]。本研究組織病理學檢查顯示術后植入部位確實存在有活性的脂肪填充物，其中間及周圍為新生毛細血管、纖維母細胞及大量膠原纖維充斥，顯示有纖維化存在，在術后12個月時仍有大量有核脂肪細胞存在。正如Brandenburg等[7]指出，術后即便脂肪組織有損壞，纖維組織也可以代替損壞的脂肪，保持聲帶的輪廓和體積。

自體筋膜填充于聲帶固有層治療聲帶固有層缺陷療效良好[2，8],但尚缺乏組織病理研究來證實。本研究顯示筋膜組織填充后在形態上可與周圍組織區分開來，填充后3個月與周圍組織無明顯分別，開始有纖維細胞及纖維母細胞長入，細胞密度較高，以橢圓形纖維母細胞為主，而這種有活性的纖維母細胞具有分泌細胞外基質的作用，使填充后的筋膜與聲帶本身生物學特性更接近。由于填充的筋膜存在時間較長，能很好的起到支架作用，使聲帶本身纖維組織、纖維母細胞及其他細胞外基質成份充分長入。筋膜與聲帶固有層周圍組織無明顯纖維包膜形成，顯示自體筋膜與聲帶有很好的生物相容性，與植入部位結合良好。6個月后筋膜組織與聲帶固有層結構趨于一致，提示聲帶溝筋膜植入術后的患者，嗓音大幅度的改善理論上應該出現于術后6個月左右。筋膜注射于聲門旁間隙和填充于固有層，兩種植入方法炎性反應均輕微，隨植入部位不同，反應有所差異，植入物周圍纖維包膜形成比例高，與周圍組織界限清晰。

可見，脂肪填充于聲門旁間隙，相對于筋膜，更能起到介質作用，使周圍的新生血管及活性纖維母細胞長入，這些新生成分的營養支持作用促進了植入的脂肪細胞的存活，但隨時間的推移，有一定的吸收率，但仍可以起到填充效果。而筋膜注射于聲門旁間隙后，是以膠原纖維的結構形式長期存在于植入部位，纖維母細胞出現的密度較大，因此筋膜移植物存在時間長，重吸收現象不顯著；但是由于筋膜的大量取材及注射方式受限，在一定程度上限制了其臨床應用。

本研究中脂肪注射組有2側聲帶病理切片未發現明確填充物存在，分別出現于術后1個月和3個月，分析原因，考慮為注射部位過于表淺、脂肪自聲帶注射部位排出有關，因此術中脂肪注射入聲門旁間隙內的深度控制非常重要。另外，由于本實驗中無法控制犬很好地聲休，致使術后1周時一例犬聲帶填充筋膜脫落(記為操作失敗未計算在內)，可見術后聲休有利于筋膜在植入部位的生長。因此，聲帶填充術中應注意，脂肪注射應采用多點分散注射，要注射在聲門旁間隙內，且要注射到一定深度；術后一定時期內限制聲帶過度活動，避免填充物排出或脫落，為新生物質生長提供基礎。隨著組織工程技術、分子生物學、基因治療等技術的進一步發展，相信聲帶填充技術必將擁有更廣闊的研究前景和臨床應用價值。

4 參考文獻

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2 徐文，韓德民，侯麗珍，等.自體筋膜移植填充治療聲帶溝[J].中華耳鼻咽喉頭頸外科雜志，2006，41：591.

3 Kruschewsky LS, de Mello-Filho FV, dos Santos AC, et al. Autologous fat graft absorption in unilateral paralyzed canine vocal folds[J]. Laryngoscope, 2007，117:96.

4 徐文，韓德民，侯麗珍，等. 聲帶外側自體脂肪注射填充術治療聲門閉合不良[J].中國耳鼻咽喉頭頸外科，2006，13:499.

5 溫武,周水淼,楊心青，等. 自體脂肪聲帶內注射術治療單側聲帶麻痹的遠期療效觀察[J].中華耳鼻咽喉科雜志,2004,39:204.

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7 Brandenburg JH, Unger JM, Koschkee D. Vocal cord injection with autogenous fat: a long-term magnetic resonance imaging evaluation[J]. Laryngoscope 1996, 106:174.

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