HPLC法測定松針中原花青素的含量

嚴(yán)子軍，韋壽蓮，汪洪武，鄧清華

（肇慶學(xué)院 化學(xué)化工學(xué)院，廣東 肇慶 526061）

松針(pine needles)是松科(Pinaceae)松屬(Pinus)植物的葉，又名松葉、松毛等.全世界共有10個屬230余種，我國松樹有10個屬120余種，可供藥用和飼用的有13種[1].松針性溫，味苦、澀，入心、脾經(jīng)[2]，其主要功效為驅(qū)風(fēng)活血、明目、安神、解毒、燥濕止癢.可治療風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、跌打腫痛、夜盲癥、高血壓、神經(jīng)衰弱、浮腫、濕瘡疥癬等，并能防治流行性感冒、流行性腦炎、鉤蟲病等[3].松針中含有揮發(fā)油類、粗蛋白、氨基酸、色素、維生素、多元酚類等多種化合物[4].原花青素是植物界中廣泛存在的一大類多酚類化合物，其基本組成為黃烷－3－醇和黃烷－3,4－二醇.原花青素是清除自由基很強(qiáng)的抗氧化劑，其抗氧化、清除自由基的能力是維生素E的50倍、維生素C的20倍.目前，原花青素已廣泛應(yīng)用于食品、藥品、化妝品等領(lǐng)域.采用高效液相色譜法測定爬山虎、葡萄籽和玫瑰花提取物中原花青素含量的研究已有報(bào)道.而國內(nèi)對松針提取物中原花青素含量測定方面的研究報(bào)道極少，更未見采用高效液相色譜法測定松針中原花青素含量的相關(guān)報(bào)道.

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 實(shí)驗(yàn)材料和試劑

實(shí)驗(yàn)所用材料和試劑如下：松針（采自肇慶北嶺山）；AB－8弱極性大孔吸附樹脂（上海潤捷化學(xué)試劑有限公司）；質(zhì)量分?jǐn)?shù)為95%的乙醇（A.R.，天津市廣成化學(xué)試劑有限公司）；石油醚（A.R.，天津市廣成化學(xué)試劑有限公司）；濃鹽酸、氫氧化鈉（A.R.，汕頭市西隴化工廠有限公司）；甲醇、乙腈(色譜純，天津四友精細(xì)化學(xué)品有限公司)；原花青素對照品（貴州迪大科技有限責(zé)任公司，純度≥99%）.

1.2 實(shí)驗(yàn)儀器

實(shí)驗(yàn)所用儀器如下：高效液相色譜儀Agilent 1200；G1314B VWD紫外檢測儀；色譜柱為Zorbax Eclipse XDB－C18(4.6mm×150mm，5μm)；GKC210R 4型可控恒溫水浴鍋（上海錦屏儀器儀表有限公司）；RE52CS旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海亞榮生化儀器廠）；800型低速離心沉淀機(jī)（深圳市沙頭角南國華儀器廠）.

1.3 松針中原花青素的提取

將干燥松針剪切后用粉碎機(jī)粉碎，過篩(孔徑為1.25mm，粒徑≤1.5mm)，采用石油醚脫脂[5]，晾干備用.稱取20.00 g脫脂松針粉進(jìn)行超聲波輔助提取.提取液是質(zhì)量分?jǐn)?shù)為60%的乙醇(料液比1:10)，溫度為40℃，pH值為4，提取時間為45m in.連續(xù)提取3次，合并提取液并過濾，將溫度控制在45℃下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮，備用.

大孔吸附樹脂預(yù)處理：按文獻(xiàn)[6]的方法預(yù)處理、平衡樹脂柱.上樣：樹脂柱平衡后，將松針提取液以1m L/m in的流速上樣.

淋洗：用20m L蒸餾水以1m L/m in的流速沖洗去除未被吸附的原花青素及小分子雜質(zhì).洗脫：用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為75%的乙醇以1.5m L/m in的流速洗脫，收集洗脫液80m L，備用.

1.4 供試溶液制備

精密量取純化后的松針提取液1m L置于10m L容量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻后再稀釋10倍，備用.

1.5 對照品貯備液

精密稱取原花青素對照品5.0mg，置于5m L的容量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，制成1.0 mg/m L的溶液，備用.

1.6 實(shí)驗(yàn)方法

色譜柱為Zorbax Eclipse XDB－C18(4.6mm×150mm，5μm)；流動相為甲醇－乙腈－水＝75:20:5；流速為0.6m L/m in；檢測波長為280 nm；進(jìn)樣量為20μL.

2 結(jié)果與討論

2.1 流動相的選擇

天然產(chǎn)物提取物中含有復(fù)雜的成分，采用HPLC分析時要對其流動相進(jìn)行優(yōu)化.嘗試以甲醇:水(V: V＝90:10)為流動相分離松針提取液，發(fā)現(xiàn)色譜峰重疊并伴隨拖尾現(xiàn)象.以甲醇:乙腈(V:V＝70:30)為流動相分離松針提取液，色譜峰沒有拖尾現(xiàn)象，但未能達(dá)到完全分離.實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)在流動相中加入少量的水有助于提高分離度，以甲醇:乙腈:水(V:V:V＝75:20:5)為流動相分離松針提取液，所得的色譜峰尖銳，分離效率高(見圖1).色譜峰經(jīng)加標(biāo)確認(rèn)，3.105m in所對應(yīng)的色譜峰為原花青素.

圖1 對照品（A）和松針提取液（B）的HPLC色譜圖

2.2 線性范圍

精密量取對照品貯備液1m L，置于5m L容量瓶，定容至刻度，再依次稀釋成不同濃度，分別進(jìn)行色譜分離分析.以濃度（mg/m L）作為橫坐標(biāo)，對應(yīng)的峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線.原花青素的線性回歸方程為y＝6 398.1x－5.492 2，R2＝0.997 5，原花青素在0.01～0.20mg/m L內(nèi)呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系.

2.3 重現(xiàn)性實(shí)驗(yàn)

取3份供試品溶液，按1.6所示實(shí)驗(yàn)方法連續(xù)測定6次，測定原花青素的峰面積和保留時間.結(jié)果發(fā)現(xiàn)原花青素的峰面積和保留時間的RSD分別為2.0%和0.12%，說明峰面積和保留時間的精密度和重現(xiàn)性良好.

2.4 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)

取同一份供試品溶液分別在配制后0、4、6、8、12 h進(jìn)樣測定，松針提取液中原花青素的峰面積的RSD＝1.6%，說明松針提取物中原花青素供試液在配制12 h內(nèi)穩(wěn)定性良好.

2.5 松針中原花青素含量的測定

取供試液6份，其中3份分別加入適量原花青素對照品溶液，按1.6所示實(shí)驗(yàn)方法測定，每份平行測定3次，結(jié)果見表1.由表1發(fā)現(xiàn)，該方法的平均回收率大于96%，RSD≤3.5%，說明該方法準(zhǔn)確、可靠，用其測得松針中原花青素的含量達(dá)3.2mg/g.

表1 松針中原花青素的測定結(jié)果及回收率(n＝3)

3 結(jié)論

筆者采用高效液相色譜法對松針中的原花青素進(jìn)行了鑒定和含量測定.實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，松針中原花青素的含量達(dá)到3.2mg/g，實(shí)驗(yàn)方法的平均回收率大于96%，RSD≤3.5%.

[1]劉曉庚,陳梅梅.我國松針的開發(fā)利用研究及進(jìn)展[J].林產(chǎn)化工通訊,2003(4):29-30.

[2]黃順東.松針臨床應(yīng)用及藥理研究概況[J].實(shí)用中醫(yī)藥雜志,2005(8):514-515.

[3]李萍,劉友平.松針研究進(jìn)展[J].成都中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào),2001(3):49-50.

[4]程扶玖,鄒運(yùn)鼎.松屬植物松針化學(xué)成分的研究[J].西北植物學(xué)報(bào),1990,10(3):232-236.

[5]徐曉云.沙棘原花青素的分離、結(jié)構(gòu)鑒定及生物活性研究[D].武漢:華中農(nóng)業(yè)大學(xué),2007.

[6]張澤生,趙春艷,曹力心,等.大孔吸附樹脂分離純化山楂果中原花青素的研究[J].現(xiàn)代食品科技,2006(2):17.