云南省家族性腺瘤性息肉病APC基因胚系突變的研究

武治國 陳明清

大腸癌是世界上高發惡性腫瘤之一,歐美國家大腸癌的發病率排在惡性腫瘤的第2位,在中國為第4～6位,近年更有上升趨勢[1]。家族性腺瘤性息肉病(familial adenomatous polyposis,FAP)和遺傳性非息肉性結直腸癌(hereditary non-polyposis colorectal cancers,HNPCC)是遺傳性大腸癌的2種主要類型，其中FAP典型的臨床表現為患病者從青春期開始結直腸黏膜出現彌漫性腺瘤性息肉，如不進行及時恰當的醫學干預，將在30歲左右發展成為結直腸癌，是導致FAP患者死亡的第一位原因[2～4]。目前臨床上，FAP患者的確診多數依賴纖維結腸鏡的檢查，但發現時一般較晚，無法提供早期診斷。隨著醫學的發展，FAP相關致病基因突變篩查可以提供臨床前期診斷，有助于早期預防及治療。近年來，云南地區大腸癌發病率成上升趨勢[5]，且云南人群FAP相關致病基因研究鮮見報道，本研究針對云南省FAP患者相關致病基因APC基因胚系突變，初步探討該地區FAP患者致病基因突變特點。

1 材料與方法

1.1 研究對象

10個FAP家系先證者(漢族7例，彝族2例，白族1例)分別來自云南省昆明市、昭通市、大理州、紅河州，均經手術和(或)家族史證實為FAP(或伴癌變)患者。經患者同意后由其介紹和引導其直系和旁系各級親屬進行遺傳學咨詢，并以先證者為中心繪制3代以上家系圖譜(圖1)。

圖1 云南省10個FAP家系圖譜

1.2 基因突變檢測方法

1.2.1 DNA提取 獲取書面知情同意書后，抽取10名先證者及其家系成員外周靜脈血各5 ml，以0.5 mmol/L 1 ml的EDTA抗凝。應用QIAamp DNA抽提試劑盒(Qiagen，Germany)按照試劑盒說明書提取DNA，應用分光光度法測定DNA濃度及純度，-20℃冰箱冷藏備用。

1.2.2 引物設計 參照文獻[6]設計APC基因各外顯子的聚合酶鏈反應(polymerase chain reaction，PCR)引物共35對，由北京賽百盛基因技術有限公司合成。

1.2.3 PCR擴增 PCR反應在MyCycler PCR儀(Bio-RaD，USA)上進行，反應總體積為30 μL∶100 ng基因組DNA，1×PCR緩沖液，2.5 mM MgCl2,10 mM dNTP，正向和反向引物各3.3 μM，1U Taq DNA聚合酶。反應條件參照文獻結合預實驗稍加調整:95℃預變性5 min(1個循環)；95℃變性30 s，57℃～61℃退火(根據預實驗各引物退火溫度)30 s，72℃延伸30 s(35個循環)；72℃最終延伸10 min (1個循環)。

1.2.4 DNA測序 PCR擴增產物純化后上ABI PRISMTM-3730XL DNA測序儀 (Applied Biosystem,Foster City,CA,USA)進行雙向DNA測序，測序引物與PCR引物相同，測序試劑為BigDyeRTerminator V3.1 Cycle Sequencing Kit。

1.2.5 測序分析 應用Chromas 2.3軟件分析測序結果，參考美國國家生物技術信息中心網站(NCBI)GenBank(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)上APC基因序列(NM-000038)，進行序列比對。

2 結果

2.1 DNA提取結果

應用分光光度法測定DNA濃度：40～100 ng/μL；純度：OD260/OD280=1.6～1.8。

2.2 PCR擴增效果

2%瓊脂凝膠電泳結果顯示，APC基因15個外顯子均得到成功擴增，PCR反應產物均為單一區帶，大小與預計擴增一致。

2.3 DNA測序結果

2.3.1 APC基因單核苷酸多態性(single nucleotide polymorphism,SNP) 對10個FAP家系先證者APC基因全編碼區行突變檢測，檢出漢族J家系先證者APC基因發生無義突變，其他的6個漢族和3個少數民族家系中未發現APC基因致病性突變，僅檢測出SNP,包括Y486Y、T1493T、G1678G、D1822V、S1756S、P1960P。經http://www.mutationdiscovery.com/md/MD.com/home_page.jsp網站上SNP數據查對，為正常人群中常見突變，均屬于SNP，考慮為非致病突變。

2.3.2 APC基因致病性突變 漢族J家系先證者APC基因檢測出無義突變(圖2)，因APC基因上核苷酸3587C>A，導致15外顯子密碼子1196從編碼絲氨酸(Ser)變為終止密碼子(S1196X)，因終止密碼子提前出現，從而使APC蛋白呈截短改變。經APC基因突變數據庫(http：//www.umd.be/APC和http://www.china-hvp.org/LOVD/home.php?%20select_db=APC)查對，國外有此突變報道，但國內尚未見此突變的相關報道。此外，該家系還檢出位于15外顯子T1493T、G1678G、D1822V、P1960P的突變，屬于SNP，考慮為非致病突變。

圖2 家族性腺瘤性息肉病患者J家系APC基因測序圖箭頭表示在此點為單核苷酸突變APC基因c.3587C>A

根據J家系先證者APC基因核苷酸3587C>A這一突變位點，篩查該家系其他8名成員，7人檢出此突變(圖1-J家系)，并經結直腸鏡檢查證實，成員Ⅱ2、Ⅱ3、Ⅱ4均發現結直腸數百個息肉；成員Ⅲ2、Ⅲ3分別為18和16歲，在降結腸和直腸部位可見十幾個息肉；Ⅲ4僅12歲，腸鏡未檢查出息肉，為基因突變攜帶者；成員Ⅲ1未攜帶這一突變，鏡下未見息肉。Ⅰ2于1991年在當地醫院行全結腸切除術，Ⅱ2在昆明醫學院第一附屬醫院接受預防性全結腸切除手術。

3 討論

3.1 FAP家系進行致病基因檢測的意義及方法

FAP是1種常染色體顯性遺傳病，位于5q21的APC基因突變是其發生的分子遺傳學基礎。自1986年Herrera首次報道APC基因后，此基因的結構及功能被認識的越來越深入，其編碼的APC蛋白有多個功能區域，直接參與Wnt信號傳導途徑，并在細胞-細胞間黏附、細胞骨架的微管穩定、細胞周期的調節、細胞凋亡中發揮作用[7]，到目前為止，已發現APC基因致病突變超過700多種[8]。此次研究的10個家系，均進行了至少3代的家系調查，其中D家系和G家系中的患者無明確的家族史，考慮是新發患者，與文獻報道20%的FAP病例無家族史相一致[9]。無論是新發FAP患者還是有家族史的FAP患者，都符合孟德爾遺傳定律，他們的子代都有50%的可能通過遺傳而攜帶突變的基因，因此，對FAP家系成員進行突變基因篩查具有重要意義。

3.2 云南地區FAP家系APC基因突變分析

在檢測出有APC基因突變的J家系中，APC基因由第15外顯子上1196密碼子從編碼絲氨酸變為終止密碼子(S1196X)，由于是終止密碼子提前出現，使APC蛋白呈截短改變，這種截短的APC蛋白丟失了其氨基端相當一部分的氨基酸序列，從而喪失其抑制腫瘤發生的生物學功能而引發腫瘤。隨后對其家系另外8名成員行該突變位點的檢測，其中7名成員有此突變，除一名12歲的基因突變攜帶者，由于未到發病年齡沒發現息肉外，其他突變成員均經腸鏡檢查出息肉。因此，APC基因S1196X突變是引起這一FAP家系發病的原因，并且，通過對這一家系成員進行基因篩查，發現了早期的FAP患者Ⅱ2、Ⅱ3、Ⅱ4、Ⅲ2、Ⅲ3及無臨床表現的致病基因攜帶者Ⅲ4，早期給予醫學干預。

此次對云南省10個FAP家系的APC基因進行分析，僅檢出1個漢族家系有APC基因致病突變，突變檢出率遠低于國內、外報道[9～14]的23.3%～78.6%和48%～87.7%。這次研究中，我們沒能確定其余9個家系的致病原因，其APC基因突變低檢出率可能的原因考慮有以下3個方面:第一，FAP患者APC基因突變率可能會存在著民族間、地域間的差異。由于不同民族不同地區的人群，其遺傳物質本身存在差異或長期地理隔離造成的生存環境的差異而導致遺傳物質的差異，國內外現有報道已提示FAP患者APC基因的檢出率在不同人種、不同地區存在差異。云南是個多民族的邊疆省份，包括漢族和彝、白、回、苗、傣、傈僳、哈尼等25個少數民族以多民族大雜居、小聚居分布為特點，具有不同民族遺傳結構的多樣性和民族背景的單一性，APC基因突變的低檢出率有可能存在云南省地區差異的因素。第二，APC基因突變陰性的FAP患者是否存在其他致病基因和修飾基因的突變。有學者報道[15]，在未檢出APC基因突變的FAP患者中，堿基剪切修復基因MYH (MutY human homologue，MYH)基因突變有25%的檢出率。Renkonen等[16]在未檢測到APC基因變異的FAP患者中，也指出有MYH或AXIN2基因的變異。FAP患者除與APC基因突變有關外，可能還存在其他發病機制。第三，APC基因突變可能存在于這些家系中，但目前檢測方法的限制，無法檢測出突變部位及類型。最近，有學者報道衰減型FAP(attenuated FAP,AFAP)患者內含子突變，導致轉錄時剪切位點發生變化。Neklason等[17]報道1例AFAP患者4號內含子突變導致APC基因4號外顯子表達缺失。我們這次研究應用DNA直接測序方法，對FAP患者APC基因的全編碼區(15個外顯子)進行檢測，內含子未在檢測范圍內。另外，DNA直接測序對基因大片段缺失或整個外顯子的缺失目前無法檢出。雖然APC基因的大片段缺失在FAP患者中不超過2%[14,18]，內含子突變致病的報道也很罕見，但這些也可能是造成我們研究中APC基因突變低檢出率的原因。

因此，對于FAP患者的基因篩查除主要的致病基因APC基因外，其他一些候選基因和修飾基因還需進一步深入研究，FAP基因篩查策略仍需進一步完善[19]。

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