耐紫杉醇人肺腺癌A549細胞株中BRCA1基因啟動子CpG島甲基化的研究

尹紅英 王紅兵

基因的突變、缺失是抑癌基因失活的主要途徑，近年來研究表明啟動子區域CpG島的甲基化是導致抑癌基因失活的又一重要途徑[1]。乳腺癌易感基因 ( breast cancer susceptibility gene,BRCA1)是參與多種腫瘤發生的抑癌基因[2]，研究表明其參與細胞周期調控、DNA損傷修復、基因的轉錄調節、細胞凋亡和泛素化等重要的細胞活動[3]。本研究采用甲基化特異性聚合酶鏈反應(MSP)技術，檢測耐紫杉醇人肺腺癌A549細胞株BRCA1基因啟動子CpG島甲基化的狀態，以探討A549/Taxol細胞對紫杉醇的耐藥機制。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

細胞基因組DNA提取試劑盒購自北京TIANGEN公司；BRCA1基因甲基化檢測試劑盒為GENMED公司產品；PCR試劑盒為 Promega公司產品；引物由上海生物工程技術有限公司合成；耐紫杉醇人肺腺癌 A549細胞株(A549/Taxol)購自南京凱基生物科技發展有限公司。

1.2 方法

1.2.1 A549/Taxol細胞培養 取A549/Taxol細胞，用含10%胎牛血清的RPMI 1640培養液，于37℃含5% CO2培養箱中培養。

1.2.2 甲基化特異性PCR(MSP) 取對數期生長的A549/Taxol細胞，參照基因組DNA提取試劑盒說明書提取基因組DNA，在UV 3 000紫外分光光度儀上測定吸光度值鑒定DNA純度，OD260/OD280比值均在1.8～2.0之間。取2 μg基因組DNA，參照BRCA1基因甲基化檢測試劑盒說明書進行甲基化修飾。分別取修飾DNA及未修飾DNA 100 ng進行MSP反應。BRCA1基因甲基化引物：M，F：5′- TCGTGGTAACGGAAAAGCGC-3′，R：5′- AAATCTCAACGAACTCACGCCG-3′。非甲基化引物：U,F：5′- TTGGTTTTTGTGGTAATGGAAAAGTGT-3′，R：5′-CAAAAAATCTCAACAAAC-TCACACCA-3′。反應體系按照PCR試劑盒推薦量25 μl體系進行：PCR混合液12.5 μl，上下游引物各1 μl，模板1 μl，無核酶水9.5 μl。MSP循環條件：95 ℃預變性12 min，95 ℃變性40 s，甲基化引物60℃退火45 s，非甲基化引物在57 ℃退火45 s，72 ℃延伸60 s，循環擴增35次，72℃ 10 min。應用Gene Amp PCR System 2400擴增儀(美國PE公司)。甲基化特異性引物(M)擴增的目的片段為75 bp，非甲基化特異性引物(U)擴增的目的片段為86 bp。取10 μl PCR產物在2.5﹪瓊脂糖凝膠上電泳，以TIANGEN 50 bp DNA Ladder(MD108-01)為標準DNA Marker同步電泳，紫外燈下觀察，凝膠成像系統記錄并分析。判斷標準[4]：M陽性、U陰性為完全甲基化；M陽性、U陽性為部分甲基化；M 陰性、U陽性為非甲基化。

2 結果

MSP結果顯示，耐紫杉醇人肺腺癌A549細胞(A549/Taxol)中BRCA1基因呈部分甲基化，見圖1。

圖1 BRCA1基因甲基化檢測(MSP) M為甲基化(75 bp)，U為非甲基化(86 bp)

3 討論

肺癌嚴重威脅人類生命與健康，其發病隱匿，進展迅速，約2/3患者確診時已失去手術機會，化療是綜合治療中的主要措施之一。紫杉醇由太平洋紫杉屬短葉紫杉中提取，它通過促進微管聚合、抑制微管解聚影響細胞的有絲分裂，進而發揮其細胞毒作用。該藥因其顯著的抗癌作用而被用于肺癌化療的一線用藥，但因易產生耐藥，在很大程度上影響了其長期療效。

BRCA1基因自 1994年被成功定位分離后，國內外學者對其進行了廣泛而深入的研究，BRCA1基因定位在17q21，是抑癌基因，阻滯細胞周期于G/M期。目前已知BRCA1基因是重要的功能基因[5]，參與細胞周期調控、基因轉錄調節、抑制細胞生長、DNA損傷修復。BRCA1基因還具有促進腫瘤細胞凋亡，抑制轉移和血管生成的作用。引起BRCA1基因表達缺失的機制主要有突變和 DNA甲基化。BRCA1基因突變與家族性乳腺癌及卵巢癌的發生密切相關，BRCA1基因啟動子甲基化主要發生在散發性乳腺癌和卵巢癌[6]。目前BRCA1基因甲基化的研究主要集中在乳腺癌及卵巢癌，在肺癌方面報道甚少。耐紫杉醇人肺腺癌A549細胞株BRCA1基因甲基化的相關基礎研究目前尚無報道。

近年來，人們逐漸認識到腫瘤是在環境因素的作用下通過遺傳學和表觀遺傳學的改變而發生的，包括癌基因的活化和抑癌基因的失活。表觀遺傳學包括DNA甲基化、組蛋白修飾、非編碼 RNA等。DNA甲基化是表觀遺傳學中研究最多的基因調控方式。抑癌基因啟動子甲基化可抑制基因表達而使其功能喪失，在腫瘤發生和發展中起重要作用。與遺傳學改變不同，表觀遺傳學改變在一定條件下可以逆轉，這一特性為疾病的治療提供新的機遇，也成為近年的研究熱點[7]。本實驗應用甲基化特異性聚合酶鏈反應(MSP)技術，檢測耐紫杉醇人肺腺癌 A549細胞BRCA1基因啟動子甲基化狀態，結果A549/Taxol細胞BRCA1基因啟動子CpG島區域存在甲基化，呈部分甲基化，為下一步研究提供依據。

[1] Deaton AM,Bird A.CpG islands and the regulation of transcription〔J〕.Genes Dev,2011,25(10):1010.

[2] Hong H,Yen HY,Brockmeyer A,et al.Changes in the mouse estrus cycle in response to BRCA1 inactivation suggest a potential link between risk factors for familial and s sporadic ovarian cancer〔J〕.Cancer Res,2010,70 (1):221.

[3] Morris JR,Boutell C,Keppler M,et al.The SUMO modification path-way is involved in the BRCA1 response to genotoxic stress〔J〕.Nature,2009,462 (7275):886.

[4] 王紅兵,王亞麗,劉德生,等.尿多酸肽對人肺腺癌A549細胞的作用及人肺腺癌A549細胞株E-cadherin基因甲基化的研究〔J〕.實用癌癥雜志,2010,25(5):445.

[5] Antill YC,Mitchell G,Johnson SA,et al.Gene methylation in breast ductalfluid from BRCA1and BRCA2 mutation carriers〔J〕.Cancer Epidemiol Biomarkers Prev,2010,19 (1):265.

[6] Kleer CG.Carcinoma of the breast with medullary-like features:diagnostic challenges and relationship with BRCA1 and EZH2 functions〔J〕.Arch Pathol Lab Med,2009,133 (11):1822.

[7] Cai FF,Kohler C,Zhang B,et al.Epigenetic therapy for breast cancer〔J〕.Int J Mol Sci,2011,12(7):4465.