甲基蓮心堿對耐長春新堿人胃癌細胞多藥耐藥性逆轉機制的初步研究

石書紅 張 輝

多藥耐藥(MDR)是化療失敗的主要原因，尋找有效的逆轉劑一直是醫學界研究的熱點。甲基蓮心堿(neferine,Nef)是從睡蓮科植物蓮成熟種子的綠色胚芽中提出的1種雙芐基異喹啉生物堿，是1種心血管方面副作用較小的新的鈣通道阻滯劑[1]。我們已研究發現Nef具有增強化療藥物抑制腫瘤細胞增殖作用[2]，在體外有化療增敏作用,本身無細胞毒作用[2]，本實驗進一步研究Nef對耐長春新堿人胃癌細胞多藥耐藥性逆轉作用及其機制，為開發具有臨床意義的MDR逆轉劑提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 藥品與試劑

甲基蓮心堿(neferine,Nef)由同濟醫學院藥理學教研室提供；長春新堿(vincristine,VCR)為廣州明興制藥廠生產；維拉帕米(verapamil,VRP)為上海禾豐制藥有限公司產品；MTT(噻唑藍)為Sigma公司產品；鼠抗人Bcl-2單抗為北京中山生物工程公司產品；SP免疫組化試劑盒為福州邁新生物公司產品；小牛血清購自杭州四季清；RPMI 1640培養基為Gibco BRL公司產品。

1.2 細胞培養

SGC7901/VCR和SGC7901細胞由第四軍醫大學西京醫院全軍消化病研究所惠贈。用含10%小牛血清的RPMI 1640細胞培養液，在37℃、5% CO2恒溫培養箱中培養。其中SGC7901/VCR 細胞加0.8～1 μg/ml VCR維持耐藥，撤藥后2周進行實驗。選對數生長期細胞進行實驗。

1.3 MTT法檢測VCR或Nef對腫瘤細胞增殖的影響

參照文獻[2]方法，以0.5×105/ml cell接種于96孔培養板，每孔100 μl,37℃、5% CO2條件下培養過夜后，加入不同濃度的Nef和(或)VCR，調零組和對照組加相應體積的培養液，每組設4個平行孔。培養72 h后，每孔加5 mg/ml MTT 20 μl(調零組除外)，再培養4 h，傾去培養液，加DMSO 100 μl/孔，待甲臢完全溶解后，應用酶聯免疫儀在波長570 nm處調零后讀取吸光度值(A)。取4孔A值的均數，按以下公式計算IR,細胞生長抑制率(%)(IR)= (1-試驗孔A均值/對照孔A均值)×100%。以上實驗重復3次。采用孫氏法求出半數抑制濃度(IC50)，并按下列公式計算耐藥及逆轉倍數。

耐藥倍數=耐藥株IC50/ 敏感株IC50

逆轉(增敏)倍數=IC50(VCR)/ IC50(VCR+Nef)

1.4 流式細胞術檢測Bcl-2蛋白表達

將含10 μmol/L Nef的培養液與細胞共同培養24 h，收集細胞制成1×106/ml的懸液，PBS洗2次，加入一抗(1∶100)20 μl，4℃避光反應45 min，用含2%小牛血清的PBS洗2次后，加入FITC標記的二抗(1∶200)20 μl，混勻，4℃避光反應30 min，PBS洗3次,流式細胞術檢測細胞熒光強度,每次測定5 000個細胞。

1.5 免疫組化法檢測細胞Bcl-2蛋白表達

將Nef加入6孔培養板中與細胞爬片培養24 h后，去掉培養液，用95%乙醇固定30 min。按SP試劑盒說明書進行操作。結果判定：細胞膜和(或)胞質被染成棕黃色為陽性細胞。

1.6 統計學處理

2 結果

2.1 Nef 的細胞毒性效應

由表1可見，不同濃度的Nef(2.5～10 μmol/L )對SGC7901及SGC7901/VCR細胞無顯著毒性作用。

表1 Nef 對人胃癌細胞生長的影響(IR,%；n=3)

2.2 Nef 逆轉SGC7901和SGC7901/VCR對VCR耐藥性的作用

由表2可見，細胞株SGC7901/VCR對VCR的IC50為2.32 μg/ml，而對應的敏感細胞株SGC7901對VCR的IC50為0.059 μg/ml，可見細胞株對VCR的耐藥倍數為39倍。不同濃度Nef均能逆轉SGC7901/VCR對VCR的耐藥性，且呈劑量依賴性；相同濃度下，Nef逆轉活性較VRP高(P<0.01)，且對敏感細胞株SGC7901有增敏作用。

表2 Nef 逆轉SGC7901及SGC7901/VCR對VCR的耐藥作用；n=3)

與對照組(單用VCR)比較，*為P<0.05,**為P<0.01；與VRP組比較，##為P<0.01

2.3 Nef對Bcl-2表達的影響

流式細胞術檢測結果顯示，SGC7901/VCR與SGC7901相比波峰右移，細胞平均熒光強度增強，說明SGC7901/VCR細胞中Bcl-2表達水平增高。經10 μmol/L Nef處理24 h后，波峰左移，細胞平均熒光強度減弱，同時對其陽性表達率進行檢測，發現SGC7901細胞中 Bcl-2蛋白表達率為2.95%，而SGC7901/VCR細胞中其表達率為31.94%，兩組比較，P<0.01；SGC7901/VCR細胞中Bcl-2呈高表達，經10 μmol/L Nef處理24 h后，其陽性表達率下降至3.19%，與SGC7901/VCR對照組相比較，P<0.01，有顯著性差異；結果表明Nef能下調SGC7901/VCR細胞中Bcl-2蛋白表達水平。

2.4 免疫細胞化學SP法檢測結果

Bcl-2陽性顆粒位于胞質和(或)胞膜，MDR細胞SGC7901/VCR中 Bcl-2呈強陽性表達，而在SGC7901細胞中呈陰性表達，經10 μmol/L Nef處理24 h后，SGC7901/VCR細胞中Bcl-2表達呈陰性；表明Nef能下調SGC7901/VCR細胞中Bcl-2表達水平。

3 討論

甲基蓮心堿是1種新的鈣通道阻滯劑，已有研究表明[1]具有與維拉帕米相似的心血管方面的作用。而維拉帕米是1種公認的體外具有強逆轉MDR活性的逆轉劑[3～5]，常做為研究MDR逆轉劑的陽性對照物。已有實驗證明[3～5]維拉帕米必須在2 μmol/L以上，才具有逆轉MDR作用，但其在體內血漿濃度達1～2 μmol/L時，就產生明顯心臟毒性：如心率減慢、低血壓、房室傳導阻滯、左心衰，進而限制其在臨床應用。

本研究結果顯示，2.5、5、10μmol/L Nef能使VCR對SGC7901/VCR細胞的IC50從2.32 μg/ml依次下降至0.340、0.128、0.053 μg/ml，逆轉倍數分別為6.8、18.1、43.8。在濃度為10 μmol/L時，Nef逆轉活性較VRP為高。說明Nef能逆轉人胃癌細胞SGC7901/VCR的多藥耐藥性,逆轉活性較維拉帕米強。另外對敏感株SGC7901細胞有化療增敏作用。

細胞凋亡是1種區別于細胞壞死的、主動的、程序化的細胞死亡形式，細胞增殖與細胞凋亡的平衡被破壞時，腫瘤就發生，故在腫瘤的發生發展中占有重要地位[6]。研究已表明細胞凋亡與腫瘤細胞的耐藥性密切相關[7]。 Bcl-2 是重要的凋亡抑制基因，其過度表達可抑制多種因素如：射線、抗癌藥及去除IL-3等誘導的細胞凋亡，是腫瘤產生多藥耐藥性的機制之一。它與傳統的腫瘤耐藥機制不同，不能阻止藥物進入細胞內，不抑制藥物引起的DNA損傷，也不改變細胞對DNA的修補速率和細胞周期動力學，而是通過抑制腫瘤細胞的凋亡途徑，延長細胞存活期導致耐藥產生。在這一延長的存活期內腫瘤細胞可發生生化或遺傳學改變，從而按經典方式產生耐藥或者只受藥物損傷的腫瘤細胞存活到藥物作用消失后，自我修復，恢復功能[8～11]。研究發現[12，13]bcl-2能增強細胞對化療藥物耐受性，與對照組相比，bcl-2并不影響藥物對腫瘤細胞增殖的抑制作用，但對維持細胞存活起重要作用。在化療藥物去除后，bcl-2蛋白能重新啟動細胞增殖，使細胞獲得耐藥性。這說明bcl-2在腫瘤MDR發生中起重要作用。

本實驗結果顯示，SGC7901/VCR細胞高表達bcl-2，而SGC7901細胞不表達Bcl-2，表明SGC7901/VCR細胞的MDR與 bcl-2過度表達有關。經10 μmol/L Nef處理24 h后，bcl-2表達水平顯著下降，表明Nef可能通過下調bcl-2表達水平而逆轉MDR，因此，我們認為在心血管方面副作用較小的甲基蓮心堿對于逆轉胃癌細胞的多藥耐藥性具有重要意義。

[1] 葉少劍，胡文淑.甲基蓮心堿的心血管作用與血管內皮及鈣的關系〔J〕.中國藥理學與毒理學雜志，1994,8(1):43.

[2] 石書紅,張 輝，莊英幟.甲基蓮心堿對長春新堿抑制人胃癌細胞增殖作用的影響〔J〕.臨床腫瘤學雜志，2008,13(5):427.

[3] Yu DS,Sun GH,Ma CP,et al.Verapamil modulation of mutidrug resistance in renal cell carcinoma 〔J〕.J Formors Med Assoc,2000,94(4):311.

[4] Fisher GA,Sikic BI.Clincal studies with modulators of multidrug resistance 〔J〕.Hematol Oncol Clin North Am,1995,9(2):363.

[5] Meister S,Frey B,Lang VR,et al.Calcium channel blocker verapamil enhances endoplasmic reticulum stress and cell death induced by proteasome inhibition in myeloma cells〔J〕.Nepoplasia,2010,12(7):550.

[6] 郭春龍，朱曉敏，曲世靜，等.紫杉醇誘導人膀胱癌EJ細胞凋亡及與Bcl-2基因表達的關系〔J〕.實用癌癥雜志,2011,26(2):124.

[7] Baguley BC.Multiple drug resistance mechanisms in cancer〔J〕.Mol Biotechnol,2010,46(3):308.

[8] Maráz A,Furák J,Pálf?ldi R,et al.Roles of Bcl-2 and MDR1 expression in the efficacy of paclitaxel-based lung cancer chemoradiation〔J〕.Anticancer Res,2011,31(4):1431.

[9] Pritchard JR,Gilbert LA,Meacham CE,et al.Bcl-2 family genetic profiling reveals microenvironment-specific determinants of chemotherapeutic response 〔J〕.Cancer Res，2011,71(17):5850.

[10] Hadjidaniel MD,Reynolds CP.Antagonism of cytotoxic ch-emotherapy in neuroblastoma cell lines by 13-cis-retinoic acid is mediated by the antiapoptotic Bcl-2 family proteins 〔J〕.Mol Cancer Ther,2010,9(12):3164.

[11] Wesarg E,Hoffarth S,Wiewrodt R,et al.Targeting Bcl-2 family proteins to overcome drug resistance in non-small cell lung cancer〔J〕.Int J Cancer,2007,121(11):2387.

[12] Krishna S,Low IC,Pervaiz S.Regulation of mitochondrial metabolism：yet another facet in the biology of the oncoprotein Bcl-2〔J〕.Biochem J,2011,435(3):545.

[13] Hanada M,Takasu H,Kitaura M.Acquired resistance to miriplatin in rat hepatoma AH109A/MP10 is associated with increased Bcl-2 expression,leading to defects in inducing apoptosis 〔J〕.Oncol Rep,2010,24(4):1011.