胃癌組織中Ezrin和nm-23的表達及臨床意義

劉換新 彭 娟 陳 娟 梁敏燕

胃癌是消化道常見的惡性腫瘤，其術后5年生存率較低，浸潤轉移是影響其療效及導致患者死亡的主要原因[1]。近年研究發現，Ezrin蛋白在許多惡性腫瘤如卵巢癌、骨肉瘤、惡性黑色素瘤等中呈高表達[2,3]，與腫瘤的轉移有高度的相關性[4～6]。nm-23基因是公認的腫瘤轉移抑制基因，其編碼的蛋白質具有維持細胞正常分裂，并抑制腫瘤細胞轉移的功能[7～10]。Ezrin蛋白在胃癌中的表達及意義國內少見報道[1]，也有學者探討了nm-23在胃癌中的表達[7]，但兩者的相關性未見報道。本研究旨在探討胃癌組織中Ezrin和nm-23在胃癌及癌旁組織中表達情況及兩者相關性，為胃癌的臨床治療及預后判斷提供依據。

1 材料與方法

1.1 標本來源

收集武警廣東總隊醫院病理科2004年3月～2006年6月胃癌手術切除標本164例，其中男性110例，女性54例；138例為無病生存(Disease-free survival，DFS)小于5年(出現遠處器官轉移)或已經死亡的病例，26例DFS大于5年的病例；年齡最大78歲，最小36歲，中位年齡47.8歲。按WHO2003年胃腫瘤組織學分類，其中高分化腺癌99例，中分化腺癌41例，低分化腺癌20例，未分化癌4例；pTNM 分期，Ⅰ期6例(3.7%)、Ⅱ期59例(35.9%) 、Ⅲ期55例(33.5%) 、Ⅳ期44 例(26.8%) ；有淋巴結轉移108例(65.9%)，無淋巴結轉移56例(34.1%)。對每1例標本經常規HE染色后，進行組織病理學觀察并做出診斷，同時取相應癌旁組織作為對照。

1.2 試劑

鼠抗人Ezrin和nm-23單克隆抗體和陽性對照片購自北京中杉生物技術有限公司，一抗工作濃度1∶200；Envision法檢測試劑盒購自基因生物技術有限公司。

1.3 免疫組織化學染色

采用Envision法，切片脫蠟至水，置入0.01/枸椽酸原修復液中，微波高溫修復10 min，然后按照公司提供的標準方法進行操作，進行顯色，常規脫水，透明，封片，用公司提供的陽性對照片為對照，用PBS替代一抗為陰性對照。

1.4 免疫組化檢測結果評定標準

光學顯微鏡下對染色情況進行評估，取5個高倍視野各計數100個細胞，Ezrin的評定標準按照Yu等[4]的分級標準分為陰性(無表達)；陽性(<50%細胞陽性表達或染色較淺)；強陽性(>50%細胞陽性表達且深染)。nm-23陽性標準參照Terada 等[7]的分級標準：以細胞質內出現均勻棕黃色顆粒為陽性染色細胞，陽性細胞數<20%為陰性表達，20%～30%為陽性表達，陽性細胞數>30%為強陽性。

1.5 統計學分析

用統計分析軟件SPSS13.0進行統計學分析，分別對各指標結果進行Wilcoxon秩和檢；采用Spearman秩相關分析對Ezrin和nm-23的相關性進行檢驗。

2 結果

2.1 Ezrin及 nm-23在胃組織中的表達

在胃癌癌旁組織中兩者均有表達，陽性信號分布于癌細胞胞膜。Ezrin和 nm-23在胃癌癌旁組織中的表達分別為21.3%(35/164)，86.6%(142/164)；在癌組織中的表達分別為48.2%(79/164)，35.4%(58/164)。癌組織中Ezrin及 nm-23的表達與癌旁組織比較，差異均有統計學意義(P<0.05)。

2.2 Ezrin和nm-23在胃癌中的表達

淋巴結轉移組與無淋巴結轉移組之間、臨床分期Ⅰ～Ⅱ期與Ⅲ～Ⅳ期之間以及DFS<5年與>5年組之間比較，Ezrin和nm-23表達差異均有統計學意義(P<0.05)，見表1。Ezrin和nm-23表達和患者年齡、性別以及腫塊大小無明顯相關性(P>0.05)。

表1 Ezrin和nm-23在胃癌中表達及其與臨床病理參數的關系(例)

2.3 Ezrin和nm-23在胃癌組織中表達的關系

分析發現，Ezrin表達高的病例，其nm-23陽性率低，而Ezrin表達低的病例，其nm-23表達率偏高，經Spearman等級相關性統計分析發現，它們之間呈負相關性(γ=-0.359，P<0.001)，見表2。

表2 胃癌組織中 Ezrin和nm-23表達間的關系(例)

3 討論

大量臨床實踐表明，腫瘤的浸潤和轉移是腫瘤患者死亡的最重要的原因。作為最常見的腫瘤之一，胃癌的5年生存率一直較低，這與胃癌的發生比較隱匿，出現臨床癥狀時已經到了中晚期有較大關系。另外，胃癌轉移的早晚存在較大個體差異，其中的原因比較復雜，諸多環節尚不清楚，但是研究人員通過大量的實驗研究發現，Ezrin蛋白與腫瘤的生長、侵襲、轉移直接相關[2,3]。Ezrin是ERM(ezrin-radixin-moesin)細胞骨架相關蛋白家族成員之一，參與細胞骨架組建，并通過MEK/ERK信號傳導途徑，誘導瘤細胞侵襲表型發生，參與細胞遷移和轉移相關的細胞內相關信號傳導。通過對骨肉瘤、黑色素瘤以及卵巢癌的研究發現，有淋巴結轉移的癌組織中Ezrin異常高表達，沒有淋巴結轉移的癌組織Ezrin表達較低，而且Ezrin的表達與患者的預后明顯相關[4～6]。研究發現，用RNAi 技術抑制Ezrin高表達的細胞株使Ezrin 表達下調后，腫瘤轉移能力明顯下降[4]。

本研究通過對2004年3月～2006年6月在我院手術的胃癌患者的資料的回顧和總結，并應用免疫組化的方法檢測胃癌組織中Ezrin的表達，結果發現，淋巴結轉移為4枚或多于4枚的患者和淋巴結轉移少于4枚的患者相比，Ezrin表達率明顯偏高，差異有統計學意義，提示Ezrin可能在胃癌淋巴結轉移過程中擔任重要的角色，Ezrin過度表達或過度活化可以促進腫瘤細胞的轉移。從實驗數據中還可以觀察到，隨著臨床分期的不斷升高(Ⅲ～Ⅳ期)，Ezrin表達率有顯著性上升，提示Ezrin過度表達的患者預后不良。另外，從數據中還可以發現，對于那些無病生存時間為5年以上的患者，Ezrin表達明顯低于那些無病生存時間小于5年的患者，這說明Ezrin對于判斷胃癌預后具有一定意義。本實驗還發現在胃癌癌旁組織以及胃良性腫瘤中均有表達，但它們的表達分布很規則，主要分布在腺上皮細胞胞膜，是1種生理性表達，與在胃癌中的表達相比有明顯的不同。

nm-23 基因表達于正常細胞,位于人類染色體17q22,包括nm-23H1 及nm-23H2 2個亞型,兩者有88% 的同源性。其突變見于多種人類腫瘤[7～10]，突變方式最常見的nm-23H1 等位基因丟失。乳腺癌和大腸癌的突變率分別為64% 和52.14%[8]，而卵巢癌的突變率更高，達76%[9]。目前大多數文獻報道肯定nm-23H1 基因突變與腫瘤轉移存在相關關系。nm23抑制轉移比較有力的證據是在乳腺癌中得到證實[8]，研究表明，nm-23蛋白與包括胃癌在內的人類多種腫瘤浸潤有關。但近年來有研究顯示，nm-23基因并不象抑癌基因p53那樣穩定，它在某些癌癥中表現比較混亂，原因是多方面的，推測改變nm-23H1的調節可能是轉移的起點，而nm-23H1位點喪失在不同腫瘤中的發生率各不相同，因而會出現不同的研究結果。但在本研究過程中，我們發現nm-23蛋白在癌旁組織中顯示高表達，在癌旁組織中，nm-23的表達率明顯高于癌組織，并有顯著性差異。在伴有淋巴結轉移的病例中，nm-23的表達率很低，另外，臨床分期早的胃癌患者，nm-23表達明顯高于分期晚的患者；而淋巴結轉移少于4枚的患者，nm-23的表達也顯著高于淋巴結轉移大于4枚的患者。從其5年無病生存率和nm-23表達相關性分析，預后佳的患者的nm-23表達陽性率比預后差的高，差異有統計學意義，表明nm-23表達水平與胃癌預后呈正相關，提示nm-23可以抑制胃癌的轉移，與其他作者的報道一致[7],提示nm-23可作為判斷胃癌轉移和預后的參考指標。同時，檢測nm-23在癌組織中的表達可能還有助于從胃癌患者中篩選出轉移高危險者進行治療。

本研究還對Ezrin和nm-23在胃癌組織中表達進行比較，發現Ezrin表達高的患者，nm-23表達低，預后差；Ezrin而表達低的患者，nm-23表達高，患者的預后相對較好，兩者之間具有負相關性(P<0.01)，提示兩者可能通過多種信號通路共同參與了胃癌浸潤和轉移，參與其中的有多種因素，有學者認為[4]Ezrin過度表達或過度活化可以使細胞之間連接松散，細胞之間的信號傳遞異常，進而促進腫瘤細胞的轉移。我們推測由于Ezrin是細胞骨架連接蛋白，Ezrin的過表達干擾了其它相關基因的功能，有可能影響到nm-23的表達。異常表達的nm-23基因可以編碼1種類似二磷酸核苷激酶(NDPK)的蛋白，參與微管的集合和分解，影響細胞的結構和細胞之間的相互關系，從而也影響了細胞的正常的生理活動，促進了癌細胞的轉移，同時也說明，nm-23的異常表達有助于新生瘤細胞的擴散。Ezrin 和nm-23兩者間相互作用的機制需要進一步的研究加以證實。

總之，我們發現Ezrin和nm-23在胃癌組織中表達高、低與胃癌的分期、轉移及預后有相關性，可作為判斷預后并用于治療的有用的參考指標。我們的研究表明，檢測Ezrin及nm-23在胃癌中的表達并綜合分析，有助于對患者預后的判斷，對指導臨床治療具有一定參考價值。

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