FOXC1與基底樣乳腺癌的研究進展

付 晶 盧康平綜述 張清媛審校

乳腺癌是女性最常見的惡性腫瘤之一。近年來，以基因表達譜為基礎的乳腺癌基因分型將乳腺癌分為4個亞型[1]，其中基底樣乳腺癌因表型獨特，侵襲性強，預后差等特點引起廣泛關注。基底樣乳腺癌(basal-like breast cancer,BLBC)是以表達基底細胞或肌上皮細胞相關蛋白為特點的乳腺癌，其雌激素受體(estrogen receptor，ER)、孕激素受體(progesterone receptor,PR)及人表皮生長因子受體 2 (human epidermal growth factor receptor-2,HER-2)常表達為陰性。BLBC好發(fā)于絕經前的非洲裔美國女性，占乳腺癌總發(fā)病率的15%，占三陰性乳腺癌發(fā)病率的60%～90%[2]，平均發(fā)病年齡為47～55歲，組織學類型以浸潤性導管癌和髓樣癌為主[3]，組織學分級高，易出現(xiàn)腦、肺轉移，且對內分泌治療及靶向治療不敏感。在BLBC所表達的標志物中，CK5/6是目前被認為診斷BLBC的指標，被廣泛應用[4]，但其表達不具特異性。因BLBC沒用統(tǒng)一的診斷標準，不同研究者定義BLBC標準不同，研究結果也不盡相同。所以BLBC的特異性分子標志物的界定成為急需解決的關鍵問題。在尋找特異性分子標志物的過程中，轉錄因子FOXC1(Forkhead box C1)因在BLBC中高表達[2]而成為研究BLBC的熱點。我們就FOXC1在乳腺癌中的表達、促進乳腺癌的發(fā)生、發(fā)展機制及其與預后的關系作一綜述。

1 FOXC1的分子結構和生物學特點

FOX(Forkhead box)家族是1個龐大的轉錄因子家族，廣泛存在于從酵母到人類的不同種屬，其成員分屬19個亞家族，即FOXA-FOXS。FOX家族成員具有高度保守的DNA結合區(qū)和轉錄調節(jié)區(qū)，主要通過轉錄調節(jié)和信號轉導途徑來調節(jié)組織特異性基因表達、胚胎發(fā)育、細胞增殖、分化、轉移和凋亡等多個生物學過程。轉錄因子FOXC1是FOX家族的一員，位于人染色體6p25基因編碼區(qū)，分子量為56789 Da，全長3.5 kb，含有1個長度為1.6 kb的外顯子，編碼的蛋白質大小為553個氨基酸。FOXC1因含有3個a-螺旋，3個β折疊和2個特征性翼狀的大環(huán)結構而呈螺旋翼狀結構。FOXC1蛋白從N端到C端的結構依次為轉錄激活區(qū)(AD1)，DNA結合叉頭區(qū)(FHD)，抑制區(qū)/磷酸化區(qū)和轉錄激活區(qū)(AD2)。叉頭區(qū)的兩端均有1個核定位信號(NLS)，位于C端的NLS為經典基序。FOXC1的功能研究主要集中在胚胎、器官發(fā)育及組織特異性基因表達方面。在FOXC1基因敲除的動物模型中觀察到，心臟、腎臟、腦膜、骨骼、體節(jié)及眼部視前段的發(fā)育均出現(xiàn)嚴重缺陷[5]。同時，F(xiàn)OXC1也是眼睛發(fā)育過程中的重要轉錄因子，其基因突變可導致多種青光眼表型和人類阿克森費爾德·里格爾綜合征(ARS)。近期研究表明，F(xiàn)OXC1在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過程中起重要作用。對婦科腫瘤的研究發(fā)現(xiàn)，宮頸癌的組織分化程度越低，侵襲性越強，F(xiàn)OXC1 蛋白表達越低，表明FOXC1蛋白的表達與宮頸癌惡性程度呈負相關[6]。

2 FOXC1與乳腺癌

2.1 FOXC1在乳腺癌分子分型中的表達

Nielsen 等提出的用免疫組化代替基因圖譜診斷BLBC的標準為ER、HER2表達陰性，基底細胞角蛋白(CK5/6，CK14，CK17)、EGFR或者 c-kit表達陽性的乳腺癌[7]。Ray等[2]在以基因圖譜分類的4種乳腺癌分子分型中分別檢測FOXC1、CK5、CK14、EGFR、c-kit及P-cadherin的表達，結果發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)OXC1在基底樣乳腺癌中表達明顯高于其他各組亞型。同樣地，在已知ER、PR和HER2表達狀態(tài)下檢測FOXC1在乳腺癌組織標本中的表達，結果發(fā)現(xiàn)，三陰性乳腺癌組FOXC1 表達顯著高于其他亞組。進一步研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)OXC1僅在表達基底細胞角蛋白的三陰性乳腺癌細胞中細胞核呈強染色。統(tǒng)計表明，F(xiàn)OXC1陽性表達伴隨基底細胞角蛋白表達，其敏感性0.81，特異性0.8。綜上所述，F(xiàn)OXC1是BLBC的特異性標志物，可以成為診斷BLBC的潛在分子標志物。

2.2 FOXC1在乳腺癌發(fā)生、發(fā)展過程中的作用機制

2.2.1 促進細胞增殖的機制 FOXC1可促進腫瘤細胞增殖。研究[2]發(fā)現(xiàn)，將表達FOXC1的質粒轉染人MDA-MB-231細胞株后，腫瘤細胞增殖能力明顯增強。應用MCF-7乳腺癌細胞株也得到同樣結果。有趣的是，研究中發(fā)現(xiàn)FOXC1高表達的MCF-7細胞在瓊脂中可以呈現(xiàn)不依賴支持物的生長。相反地，將基因敲除的FOXC1 shRNA轉導到高表達內源性FOXC1的Ⅳ期人乳腺癌鼠模型[8]中，該模型成瘤能力明顯減弱。通過對BT549人乳腺癌細胞株的研究也得到同樣的結果。此外，研究[2]還發(fā)現(xiàn)FOXC1可促進cyclin D1表達增加。在正常乳腺細胞中，cyclin D1在細胞周期G1/S期發(fā)揮限速作用。而在乳腺癌細胞中，原本在S期降解的cyclinD1被激活并高表達，導致乳腺癌細胞的G1期縮短，提前進入S期，進而細胞增殖失控，腫瘤形成。因此，F(xiàn)OXC1可能通過調節(jié)cyclin D1的表達參與細胞增殖的調控。

2.2.2 促進細胞浸潤、轉移的機制 研究發(fā)現(xiàn)FOXC1可促進MMP2和MMP9表達增加[2]。MMP2和MMP9是金屬蛋白酶家族成員中已知與乳腺癌關系最密切的2個因子，可通過降解細胞外基質促進癌細胞浸潤、轉移。MMP2和MMP9可能作為FOXC1的下游靶點，參與FOXC1對細胞浸潤、轉移的調控。統(tǒng)計資料[2]表明，乳腺癌腦轉移患者FOXC1表達增多，且FOXC1表達增加與乳腺癌腦轉移患者數(shù)量增多成正相關。有趣的是，F(xiàn)OXC1雖然在乳腺癌腦轉移的患者中高表達，但FOXC1并非是乳腺癌腦轉移的主控基因,提示 FOXC1可能在此過程中起到協(xié)同作用。另外，研究還發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)OXC1可促進波形蛋白、纖維連接蛋白和a-平滑肌肌動蛋白等成纖維細胞標志物的表達升高；相反，在FOXC1蛋白缺失的4T1細胞中可觀察到成纖維樣細胞轉變成上皮樣細胞的現(xiàn)象出現(xiàn)。這兩項結果表明FOXC1可誘導上皮細胞發(fā)生上皮間質轉化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)。上皮細胞在EMT的過程中因喪失極性，而獲得活動能力，可在細胞基質間游走[9]，形成局部擴散，進而侵入淋巴管及血管，從而發(fā)生轉移[10]。Bloushtain-Qimron等[11]在MCF-12A細胞株中證實了FOXC1誘導乳腺癌上皮細胞發(fā)生EMT的作用。另有研究[12]表明，在緊密連接蛋白claudin呈低表達的乳腺癌中，F(xiàn)OXC1過表達不僅能作為EMT的獨立誘導劑，還能上調其他EMT誘導劑，如Goosedoid、Snail、Twist和TGF-β1等，這些因子協(xié)同參與EMT的發(fā)生。

2.2.3 促進血管、淋巴管發(fā)育的機制 在脈管形成過程中，F(xiàn)OXC1參與成血管細胞動脈分化、動脈標志物誘導和淋巴管的出芽生成。Seo[13]和Hayashi等[14]的研究表明， FOXC1通過激活Dll4和Hey2的啟動子誘導動脈標志物Notch1和Dll4的過表達，并在 VEGF-Dll4-Notch-Hey2信號通路作用下共同調節(jié)動脈基因的表達。實驗表明FOXC1參與成血管細胞動脈分化的調節(jié)。FOXC1和FOXC2復合突變的鼠胚胎模型表現(xiàn)出在主動脈弓水平，背主動脈和前主靜脈融合，動脈標志物的誘導缺陷，而靜脈標志物正常表達，這進一步說明突變的上皮細胞因為動脈分化失敗而導致動靜脈畸形的發(fā)生和血管重塑的缺陷[13]。Hayashi等[15]研究表明FOXC1還通過激活CXCR4啟動子調節(jié)細胞遷移。FOXC1缺失的內皮細胞CXCR4表達下降，同時CXCL12誘導細胞遷移能力也隨之下降。已知CXCR4-CXCL12信號通路可啟動腫瘤原有血管生長或來自骨髓募集的表達CXCR4的內皮干細胞生長來誘導新生血管生成[16,17]。這一結果提示FOXC1可能通過CXCR4-CXCL12信號通路參與腫瘤血管的生成，進而促進腫瘤轉移。另外，研究[13]還表明FOXC復合突變(FOXC1+/-;FOXC2-/-)導致淋巴上皮細胞在淋巴系統(tǒng)形成早期出芽生成障礙。FOXC1在主靜脈周圍的間質細胞中表達，而這一區(qū)域是淋巴內皮細胞分化和淋巴系統(tǒng)出芽生成的場所。在FOXC基因突變的鼠模型中，表達Prox1(淋巴內皮細胞標志物)的淋巴內皮細胞數(shù)量明顯減少，而且淋巴囊的形成也出現(xiàn)異常。雖然還沒有FOXC1直接參與腫瘤血管及淋巴管生成的研究，但這些實驗結果提示FOXC1可能在這一過程中起重要作用，但還有待進一步的研究證實。

3 FOXC1與基底樣乳腺癌預后的關系

FOXC1的表達與基底樣乳腺癌患者預后相關。Dejeux等[18]的研究指出，F(xiàn)OXC1在BLBC中通常呈現(xiàn)低甲基化狀態(tài)，且FOXC1無甲基化的乳腺癌患者死于乳腺癌的風險高于FOXC1甲基化的乳腺癌患者。Ray等[2]根據(jù)乳腺癌患者病灶組織中是否表達FOXC1，將295例Ⅰ～Ⅱ期乳腺癌患者分組，再依據(jù) FOXC1mRNA水平將其分成2個亞組，分別統(tǒng)計各組的10年生存率。統(tǒng)計結果如下：FOXC1表達組與FOXC1無表達組10年生存率分別為55%和75%(P=0.0004)；FOXC1mRNA高表達組與FOXC1mRNA低表達組分別為55%和75%(P=0.0001)。實驗證明FOXC1表達水平與三陰性乳腺癌患者預后呈負相關。研究者[19]再次根據(jù)BLBC的生物學分子標志物將其分為3種模型，分別為3-分子標志物模型(TNP即ER-，PR-，HER2-)、4-分子標志物模型(TNP+FOXC1)和5-分子標志物模型(TNP+CK5/6+CK14)。結果發(fā)現(xiàn)，與其他兩組比較，4-分子標記物模型的BLBC患者5年及10年總生存率最低。4-分子標記物模型因生存率最低而對預后有重要預測價值。該實驗進一步證明了FOXC1可成為BLBC的預后指標，且最有可能真實再現(xiàn)BLBC分子亞型的生物學特點。

基因表達譜是檢測BLBC的金標準，但因成本高限制該方法在臨床上的應用。免疫組化作為更經濟，更便捷的檢測方法被普遍采納。然而目前國際上沒有統(tǒng)一的界定BLBC診斷標準的免疫組化標識，建議的診斷性免疫組化標志物TNP、CKs、EGFR和c-kit缺乏特異性，不能全面反應BLBC的特點。研究表明FOXC1在BLBC中特異性表達，并在乳腺癌發(fā)生發(fā)展的過程中起著促進增殖、轉移、浸潤的作用，其作為免疫組化標識能更好地體現(xiàn)BLBC的生物學特性。FOXC1蛋白是BLBC的潛在診斷分子標志物和特異性預后生物標志物。針對FOXC1在乳腺癌形成過程中的作用，對其行以FOXC1為靶點的治療為個體化治療BLBC指明了方向，而FOXC1蛋白能否對BLBC有治療意義還有待進一步的研究證實。

[1]Perou CM,Sorlie T,Eisen MB,et al.Molecular portraits of human breast tumours〔J〕.Nature,2000,406(6797):747.

[2]Ray PS,Wang J,Qu Y,et al.FOXC1 is a potential prognostic biomarker with functional significance in basal-like breast cancer〔J〕.Cancer Res,2010,70(10):3870.

[3]許麗娟，劉 彤，楊建杰，等.三陰性乳腺癌與基底細胞樣乳腺癌臨床病理分析〔J〕.實用癌癥雜志，2010,25(1):62.

[4]張英軍，吳君心，侯如蓉.乳腺癌的分子分型〔J〕.實用癌癥雜志,2012,27(1):98.

[5]Carlsson P,Mahlapuu M.Forkhead transcription factors:key players in development and metabolism〔J〕.Dev Biol,2002,250(1):1.

[6]王露穎，楊正才，楊 竹.FOXC1蛋白在子宮頸癌及子宮內膜癌中的表達及意義〔J〕.重慶醫(yī)科大學學報,2010,35(4):95.

[7]Nielsen TO,Hsu FD,Jensen K,et al.Immunohistochemical and clinical characterization of the basal-like subtype of invasive breast carcinoma〔J〕.Clin Cancer Res,2004,10(16):5367.

[8]Aslakson CJ,Miller FR.Selective events in the metastatic process defined by analysis of the sequential dissemination of subpopulations of a mouse mammary tumor〔J〕.Cancer Res,1992,52(6):1399.

[9]Greenburg G,Hay ED.Epithelia suspended in collagen gels can lose polarity and express characteristics of migrating mesenchymal cells〔J〕.J Cell Biol,1982,95(1):333.

[10] Thiery JP.Epithelial-mesenchymal transitions in tumour progression〔J〕.Nat Rev Cancer,2002,2( 6):442.

[11] Bloushtain-Qimron N,Yao J,Snyder EL,et al.Cell type-specific DNA methylation patterns in the human breast〔J〕.Proc Natl Acad Sci U S A,2008,105(37):14076.

[12]Taube JH,Herschkowitz JI,Komurov K,et al.Core epithelial-to-mesenchymal transition interactome gene-expression signature is associated with claudin-low and metaplastic breast cancer subtypes〔J〕.Proc Natl Acad Sci U S A,2010,107(35):15449.

[13] Seo S,Fujita H,Nakano A,et al.The forkhead transcription factors,Foxc1 and Foxc2,are required for arterial specification and lymphatic sprouting during vascular development〔J〕.Dev Biol,2006,294(2):458.

[14]Hayashi H,Kume T.Foxc transcription factors directly regulate Dll4 and Hey2 expression by interacting with the VEGF-Notch signaling pathways in endothelial cells〔J〕.PLoS One,2008,3(6):2401.

[15] Hayashi H,Kume T.Forkhead transcription factors regulate expression of the chemokine receptor CXCR4 in endothelial cells and CXCL12-induced cell migration〔J〕.Biochem Biophys Res Commun,2008,367(3):584.

[16]Burger JA,Kipps TJ.CXCR4:a key receptor in the crosstalk between tumor cells and their microenvironment〔J〕.Blood,2006,107(5):1761.

[17]Petit I,Jin D,Rafii S.The SDF-1-CXCR4 signaling pathway:a molecular hub modulating neo-angiogenesis〔J〕.Trends Immunol ,2007,28(7):299.

[18]Dejeux E,Ronneberg JA,Solvang H,et al.DNA methylation profiling in doxorubicin treated primary locally advanced breast tumours identifies novel genes associated with survival and treatment response〔J〕.Mol Cancer,2010,9:68.

[19]Ray PS,Bagaria SP,Wang J ,et al.Basal-Like breast cancer defined by FOXC1 expression offers superior prognostic value:a retrospective immunohistochemical study〔J〕.Ann Surg Oncol,2011,18(13):3839.