VEGF-C，VEGF-D在乳腺癌中的表達及其與淋巴結轉移及預后的關系

趙迎春 李 勇 朱永云 羅傳瑜

近年來我國乳腺癌的發病率呈持續上升趨勢、死亡率占女性惡性腫瘤死亡率的第2位[1]，嚴重威脅女性健康。乳腺癌的淋巴結轉移是其最主要的轉移形式，也是臨床評估乳腺癌患者病情及預后的重要指標，但乳腺癌淋巴結轉移機制目前尚不十分明確。血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)家族的血管內皮生長因子-C(VEGF-C)和VEGF-D 以及位于淋巴管內皮上的血管內皮生長因子受體(VEGFR-3)是目前公認的調控淋巴管生成最為重要的信號傳導通路的生長因子，能夠誘導淋巴管的生成及腫瘤細胞的淋巴結轉移,但其在乳腺癌淋巴結轉移及預后中的作用尚不明確。 我們對VEGF-C,VEGF-D在乳腺癌淋巴結轉移中的作用以及對于乳腺癌患者預后的影響進一步探討，以期為預測乳腺癌淋巴結轉移及預后提供依據，為乳腺癌的綜合治療提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 一般資料

選取2005年10月～2006 年10月在蕪湖市第二人民醫院乳腺外科接受診斷和治療及資料完整、經手術病理確診的78例乳腺癌患者為研究對象。全部患者為女性，平均年齡為50.8歲(29～72歲)；其中淋巴結轉移者36例，未轉移者42例；浸潤性導管癌69例,浸潤性小葉癌9例；腫瘤直徑<2 cm者21例，腫瘤直徑≥2 cm者57例；按國際抗癌聯盟(UICC)TNM分期Ⅰ期16例，Ⅱ期44例，Ⅲ期18例；患者術前均未接受過化療、放療等治療。以同期送檢的30例癌旁組織作為研究對照。

1.2 免疫組化染色

78 例乳腺癌及30例乳腺癌癌旁正常組織蠟塊均行4 μm 連續切片，分別作HE和免疫組織化學染色。鼠抗人VEGF-D 多克隆抗體、鼠抗人VEGF-C單克隆抗體購自美國R&D公司，采用免疫組化SP(鏈霉素親生物素一過氧化物酶)法,觀察血管內皮生長因子C、D在乳腺癌組織及癌旁組織中的表達。用已知的乳腺癌陽性切片作陽性對照，用PBS液代替一抗作為陰性對照。

1.3 結果判定

VEGF-C,VEGF-D陽性染色指顯微鏡下觀察細胞胞質內具有清晰可見的，定位準確的棕黃色顆粒，而背景清晰。每張切片選擇有代表性的區域，在100倍視野下觀察5個視野，根據陽性細胞染色強度及陽性細胞的面積來判斷結果。陽性細胞的染色強度按照無著色、淡黃、棕黃、棕褐色分別記為0,1,2,3分。陽性細胞的面積分為0%為0分，1%～10%為1分，11%～50%為2分，50%～75%為3分，≥75%為4分。兩項乘積0～3分為低表達，≥4分為高表達。

1.4 隨診

患者治療結束后，前兩年每3個月回院復查，以后每6個月復查，未定期復查的通過電話方式隨訪。截止至2011年12月，所有病例都完成至少5年的隨訪,78例患者均有完整隨訪資料。

1.5 統計學處理

采用SPSS17.0統計軟件包進行分析。各相關因素的差異性比較采用χ2檢驗，生存分析選用Kaplan-meier法，顯著性檢驗采用Log-rank檢驗。P≤0.05為差異有統計學意義。所有數據采用SPSS17.0統計軟件進行處理。

2 結果

2.1 乳腺癌組織、腫瘤旁正常組織中VEGF-C、VEGF-D蛋白的表達情況

乳腺癌組織免疫組化染色結果顯示VEGF-C、VEGF-D蛋白高表達率分別為47.4%(37/78)、32.1%(25/78)；30例乳腺癌旁正常組織中分別有4例和1例高表達，高表達率分別為13.3%(4/30)、3.3%(1/30)，兩者蛋白表達水平差異均有統計學意義(P<0.01),說明腫瘤組織中VEGF-C及VEGF-D的表達水平明顯高于腫瘤周邊正常組織。進一步分析腫瘤組織中VEGF-C與VEGF-D表達的相關性發現，VEGF-C與VEGF-D的表達無明顯相關性(P>0.05)。

2.2 乳腺癌中VEGF-C、VEGF-D蛋白表達與臨床病理因素的關系

78例乳腺癌組織中VEGF-C、VEGF-D蛋白的表達水平與年齡、腫瘤大小、臨床分期及ER,PR,Her-2的表達情況無關(P>0.05)。但VEGF-C/D的表達水平與腫瘤脈管內浸潤及淋巴結轉移密切相關(P<0.05)，見表1。

2.3 VEGF-C,VEGF-D的表達水平與乳腺癌患者的總生存期(OS),無病生存期(DFS)的關系

Kaplan-meier生存曲線顯示乳腺癌患者的OS與VEGF-C,VEGF-D的表達水平呈負相關,VEGF-C，VEGF-D高表達者OS明顯低于VEGF-C,VEGF-D低表達者，Log-rank檢驗P=0.024(VEGF-C)和P=0.035(VEGF-D),見圖1A,B。同時Kaplan-meier生存曲線顯示乳腺癌患者的DFS也與VEGF-C/D的表達呈負相關，VEGF-C/D高表達者DFS明顯低于VEGF-C/D低表達者，Log-rank檢驗P<0.05,見圖1C,D。

表1 VEGF-C、D的表達與乳腺癌臨床病理因素的關系

圖1 VEGF-C/D表達水平與患者OS,DFS關系的生存曲線

3 討論

乳腺癌是女性最常見的惡性腫瘤之一，淋巴結轉移被認為是乳腺癌患者最重要的預后指標之一。過去，淋巴結轉移被認為是1個被動過程， 脫落的腫瘤細胞通過原有的局部淋巴管的引流到達淋巴結。而目前大量研究表明淋巴管生成作為腫瘤淋巴結轉移的機制已被多數學者認可，淋巴管生成受淋巴管生成因子及其受體的介導和調控，VEGF-C和VEGF-D 是最先被確認能在體內介導新生淋巴管生長的生長因子。

VEGF-C于1996年從人前列腺癌細胞系PC3中分離純化，是最早被發現的促淋巴管生成因子，具有調節血管生成、淋巴管生成和脈管通透性等作用，參與多種生理和病理過程。但目前的多數研究證實VEGF-C通過與其受體VEGFR-3特異性結合后經絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)和磷脂酰肌醇-3激酶(phosphatidy1inositol-3 kinase)途徑調控淋巴管內皮細胞增生，誘導腫瘤淋巴管生成是各類腫瘤淋巴結轉移的重要機制[2]。動物實驗及臨床研究均發現VEGF-C和VEGFR-3表達增高可促進腫瘤淋巴管生成及增加淋巴管密度，從而促進淋巴結轉移，并與諸多瘤體的預后密切相關，包括頭頸部鱗癌、甲狀腺癌、前列腺癌、黑色素瘤、胃癌、結直腸癌等[3～6]。Hu等[7]用免疫組化法檢測98例乳腺癌發現VEGF-C表達陽性率為90.8%，且淋巴結轉移組VEGF-C表達陽性率顯著高于淋巴結轉移陰性組，表明VEGF-C與乳腺癌淋巴結轉移相關。Huang等[8]用免疫組化及原位雜交法檢測89例原發性乳腺癌發現VEGF-C 陽性表達率55.06%，VEGF-C表達與淋巴管密度及腋窩淋巴結轉移呈正相關；VEGF-C mRNA表達陽性組淋巴管密度及腋窩淋巴結轉移率顯著高于VEGF-C mRNA表達陰性組。同時Mohammed等[9]研究認為VEGF-C的表達水平與腫瘤的淋巴管密度，淋巴結轉移密切正相關，而且VEGF-C表達水平與患者發生遠處轉移及總生存率密切相關，VEGF-C表達水平越高患者越可能發生遠處轉移，總生存率顯著降低。Mandriota等[10]和Koptstein等[11]通過對雙重轉基因小鼠胰腺β細胞模型的研究，發現VEGF-C/VEGF-D高表達的轉基因小鼠，能特異性地促進胰島周圍的淋巴管生成及遠處轉移，提供了VEGF-C/VEGF-D-VEGFR-3信號通路特異性介導新生淋巴管生成、促進腫瘤細胞播散和向區域淋巴結轉移的直接證據。本組試驗結果顯示乳腺癌組織中VEGF-C高表達率為47.4% ，顯著高于乳腺良性疾病(P<0.05)，顯示VEGF-C在乳腺癌中過表達；乳腺癌VEGF-C蛋白的表達與患者年齡、腫瘤大小、臨床分期以及激素受體狀態等無關(P>0.05)，但與患者的淋巴結轉移以及脈管內侵犯密切相關(P<0.05)，腫瘤發生淋巴管浸潤及淋巴結轉移，VEGF-C表達水平越高，與近期上述的國內外研究報道基本一致。同時本研究同時發現VEGF-C的表達水平也與患者的總生存率及無病生存率密切相關，這與Nakamura等[12]的研究報道一致，VEGF-C表達水平越高，患者的總生存率及無病生存率越低。上述的研究結果提示VEGF-C可能與淋巴管內皮細胞上VEGFR-3特異性結合，刺激淋巴管內皮細胞增殖，形成新生淋巴管，導致癌周組織中淋巴管密度的增高，為腫瘤的淋巴道轉移創造有利條件，而且新生淋巴管管壁較薄，基膜不連續或缺少基膜，更有利于腫瘤細胞播散、存活及轉移，從而導致患者更差的生存期。

VEGF-D是Achen等在1998年研究發現的。但目前對于VEGF-D 在乳腺癌中的表達水平，與淋巴結轉移的關系以及其預后價值，目前仍存在爭議。部分研究結果認為VEGF-D的高表達與惡性腫瘤的淋巴結轉移或不良預后密切相關，但也有研究認為兩者間沒有顯著相關性。Koyama[13]和Hanrahan等[14]研究認為VEGF-D的表達水平在腫瘤中并不明顯升高，而在正常組織中明顯升高，并與患者的淋巴結轉移及預后無明顯相關性。但大多數研究者認為VEGF-D是腫瘤淋巴結轉移的預測因素或者是獨立的預后因素。Stacker 等[15]在小鼠腫瘤異種移植模型中證實VEGF-D 能夠誘導腫瘤內淋巴管的形成， 此外腫瘤細胞上表達的VEGF-D能夠促進腫瘤細胞向淋巴結轉移。用VEGF-D的特異性抗體VD1可以阻斷VEGF-D介導的淋巴管擴散。同時有研究[16]表明VEGF-D 還是乳腺癌細胞的重要存活因子，表達VEGF-D的乳腺癌細胞系MCF-7和MDA-MB-231能夠抵抗由缺氧、星形孢菌素(STS)和環己酰亞胺(CHX)誘發的凋亡， 這可能和Bcl-2表達增加，caspase 活性降低和聚ADP-核糖聚合酶(PARP)剪切受抑制有關。Nakamura等17]研究也認為VEGF-D在乳腺癌中明顯表達增強，并與患者的淋巴管密度及淋巴結轉移密切相關，VEGF-D的表達水平與患者的預后呈明顯的負相關。上述實驗結果的差異性究其原因可能是由于這種生長因子在不同腫瘤內酶解加工的程度不同， 或是同時存在其它淋巴管生長因子的調控機制。另外，不同研究結果間的差異也可能與實驗標本本身、實驗使用的抗淋巴管標記物或檢測方法不同有關。在本研究中VEGF-D在乳腺癌中的高表達率明顯升高，提示VEGF-D 在乳腺癌中也是過表達的，同樣VEGF-D的表達水平與年齡，腫塊大小，臨床分期等臨床病理因素無關，但VEGF-D 的表達水平與患者的淋巴結轉移及脈管內侵犯密切相關，淋巴結轉移組及脈管內侵犯組中VEGF-D的高表達率明顯高于淋巴結未轉移及脈管內未侵犯的患者。同時本研究也發現，VEGF-D的表達水平與患者的總生存率(OS)及無病生存率(DFS)密切相關，這也與Nakamura等[17]的結果相近。

綜上所述，本項研究表明VEGF-C，VEGF-D的表達水平與乳腺癌脈管內侵犯及淋巴結轉移密切相關，并且VEGF-C、D的表達水平與患者的總生存期，無病生存期也密切相關。通過對VEGF-C、D表達水平的檢測或許能夠對腋窩淋巴結轉移風險和評價患者預后提供一定幫助。但對于兩者在乳腺癌中的相互作用以及在乳腺癌的淋巴結轉移中所起的作用尚需進一步研究，并希望能夠對乳腺癌的淋巴結轉移治療提供新的思路。

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