非小細胞肺癌患者外周血Lunx mRNA的檢測及意義

邱素芳 陳巖松 陳 燕 潘建基

近年來，RT-PCR方法被廣泛應用于各種腫瘤微轉移的檢測，在肺癌微轉移檢測中，常用的上皮特異性標志物由于假陽性的存在而使其應用受到限制，目前仍缺乏公認的分子標志物[1，2]。Iwao等[3]采用mRNA差異顯示技術篩選克隆了1個人類肺組織特異性基因lunx，試驗表明lunx在所有正常肺組織及非小細胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)組織中特異表達，而在其他人類腫瘤及正常組織中極少表達或不表達,且lunx在正常間葉組織中不表達。因此，lunx可望成為肺癌微轉移檢測的特異分子標志物。本實驗以lunx為靶基因采用實時熒光定量RT-PCR法檢測了肺癌患者外周血的lunx mRNA，以檢驗其作為肺癌微轉移分子標志物的可行性。

1 材料與方法

1.1 研究對象

福建省腫瘤醫院2007年6月～2008年12月確診為非小細胞肺癌患者共50例，男性30例，女性20例，年齡45～67歲，治療前抽取外周血行FQ-RT-PCR檢測lunx mRNA；對照組為同期我院胸外科住院的良性肺疾病患者(肺大泡、肺結核球、炎性假瘤)20例，男性12例，女性8例，年齡35～65歲；健康體檢者30例，男性15例，女性15例，年齡35～65歲。

1.2 實驗材料與儀器

主要實驗材料：淋巴細胞分離液購自中科院血液病研究所，Trizol試劑、逆轉錄試劑盒及實時熒光定量RT-PCR試劑盒由中山大學達安基因診斷中心提供。主要儀器：美國ABI7300擴增儀。

1.3 實驗方法

1.3.1 標本采集與處理 各入組病例及對照均按標準操作程序抽取靜脈血5 ml，置于EDTA-K2抗凝管中，(為避免上皮細胞污染，所有標本均采集2管，以第2管血為分析樣本)，于抽血完成后2 h內用淋巴細胞分離液分離各標本中單個核細胞，于-80℃冰箱中保存，待行進一步的總RNA的提取。

1.3.2 引物、探針設計與合成 采用固相亞磷酰胺合成法合成引物與探針，實驗方法采用巢式 FQ-RT-PCR法，目的基因Lunx:外側引物(F)5'-AGTGATTCCTGGCCTGAACAAC-3';外側引物(R)5'-CCTCTCCTGCTTATCTCTCACAGC-3'。內側引物(F)5'-CCTGATGGCCACCGTCTCT-3';內側引物(R)5'-GGGCGTATTCACTTGGAGCTT-3' 。巢式PCR第2輪擴張片段長度為63 bp。探針：5'-FAM-TGTCACCATCCCTCTCGGCA-TAMRA-3' 。以上引物和探針由中山大學達安基因診斷中心提供設計與合成。

1.3.3 RNA的提取和逆轉錄 采用Trizol試劑溶解細胞，硫氰雙胍、酚、氯仿一步法提取待測樣本總RNA。用紫外分光光度計測定總RNA量，A260/A280介于1.7～2.0之間，1%瓊脂糖凝膠電泳觀察RNA的完整性，EB染色可見28 s、18 s條帶。

1.3.4 cDNA的合成 按照試劑盒說明書進行。將提取的RNA樣本進行逆轉錄反應。反應體系如下：5X逆轉錄Buffer 4 μl,10P下游引物(外)R 0.4 μl,dNTPs 0.5 μl,逆轉錄酶(MMLV) 1 μl，DEPC水 10.1 μl，RNA模板 4 μl，總體積20 μl。反應條件：37℃ 1 h，然后95℃ 3 min。得到的cDNA產物于-20℃保存。

1.3.5 巢式PCR第1輪擴增 取5 μl逆轉錄反應獲得的cDNA模板，按以下反應體系進行第1輪的PCR擴增。5X定性PCR Buffer 10 μl,10P上游引物(外)(F) 1 μl,10P下游引物(外)(R) 1 μl,dNTPs 1 μl,Taq酶1 μl，DEPC水 31 μl，cDNA模板 5 μl，總體積50 μl。反應條件：93℃ 5 min；然后93℃ 30 s，55℃ 45s，72℃ 45 s，共40循環；最后72℃ 7 min。

1.3.6 巢式PCR第2輪擴增 取5 μl第1輪PCR擴增產物為模板，按以下反應體系進行第2輪的PCR擴增。5X定量PCR Buffer 10 μl,10P上游引物(內)(F) 1 μl,10P下游引物(內)(R) 1 μl,探針probe 1 μl,dNTPs 1 μl,Taq酶1 μl，DEPC水 30 μl，模板 5 μl，總體積50 μl。反應條件：93℃ 2 min；然后93℃ 30 s，55℃ 45 s，72℃ 45 s，共40循環；在每次PCR擴增的延伸階段由擴增儀自動進行熒光信號的收集及檢測。

1.3.7 陽性標準品的制備及擴增 Lunx 基因陽性標準品由中山大學達安基因診斷中心構建及定量賦值，濃度為5.3×1012/ml。將標準品稀釋成系列梯度，方法如下：取1 μl加水999 μl充分混勻作1000倍稀釋，再取5 μl按10倍依次稀釋為108、107、106、105、104。在對樣本進行第2輪PCR擴增的同時,取107、106、105、1044個梯度標準品進行PCR擴增,條件與1.3.6一致。

1.4 結果判定

待分析樣本是否為陽性通過擴增曲線判定,典型的擴增曲線應為“S”型。擴增儀根據系列濃度的標準品的熒光信號值與循環數繪制標準曲線,并根據標準曲線對樣本Lunx mRNA進行定值。

1.5 統計學分析

應用SPSS13.0統計軟件進行數據處理。χ2檢驗及Fisher確切概率法，以P<0.05為具有顯著性意義。

2 結果

2.1 Lunx mRNA標準品擴增曲線及標準曲線

擴增曲線呈典型的“S”型，標準曲線的線性相關性良好，見圖1、圖2。檢測靈敏度為1000拷貝數/毫升。

圖1 Lunx mRNA標準品擴增曲線

圖2 Lunx mRNA標準品標準曲線

2.2 非小細胞肺癌患者組與各對照組Lunx mRNA的檢測結果

結果顯示，NSCLC組Lunx mRNA中位拷貝數(表1)為31 000 copies/ml,陽性率為56%，2個對照組中位拷貝數及陽性率均為0,NSCLC組與2個對照組的差異均有統計學意義(P<0.01)。

表1 肺癌患者及對照組lunx mRNA檢測結果

2.3 NSCLC組外周血Lunx mRNA的表達情況與臨床病理特征的關系

NSCLC組外周血Lunx mRNA的檢測結果與年齡、性別、病理類型無明顯關系(P<0.05)；與臨床分期有密切關系，中位拷貝數及陽性率隨腫瘤臨床分期的增加而升高(表2)。

表2 Lunx mRNA表達與NSCLC各項臨床因素相關性分析

3 討論

腫瘤微轉移是指惡性腫瘤發展過程中，播散并存在于血液循環、淋巴道、骨髓及各組織器官中的腫瘤細胞，但尚未形成轉移性結節，且無任何臨床表現，常規病理學、影像學等方法難以發現和檢測到的轉移，是判斷復發、轉移和預后的重要指標[4]。

近30年來，盡管隨著外科技術的發展，放療技術的改進，化療新藥的應用以及基因，生物治療技術的開展，肺癌的綜合治療達到了1個新的水平。但到目前為止，肺癌患者的預后仍沒有明顯改善，即便是認為可完全切除的Ⅰ～Ⅲa期患者，5年生存率仍在30%～40% ，肺癌患者的預后與癌細胞的轉移密切相關。絕大多數患者最終死于復發和轉移[5～7]。統計表明，大約40.0%的肺癌患者就診時已有遠處轉移。肺癌轉移常通過血液和淋巴循環，癌細胞進入循環系統是轉移發生的早期。因此。循環中檢測出癌細胞在一定程度上表明腫瘤具有較強的轉移傾向，這無疑將有助于臨床腫瘤的分期和治療方案的選擇。

目前用于檢測NSCLC微轉移的分子標志物主要分為組織特異性標志物和腫瘤特異性標志物，前者如人肺組織特異性標志物，后者如癌胚抗原等。人肺組織特異性標志物Lunx是Iwao[3]等通過mRNA差異顯示技術分離的1個基因，它編碼含257個氨基酸，分子量為26.7 kDa的蛋白質。Iwao等[3]用lunx mRNA RT-PCR法檢測了NSCLC患者手術切除淋巴結的微轉移，結果表明該方法具有很高的敏感性和特異性。2003年Mitas等[8]用PCR法檢測肺癌患者外周血，結果41.7%(10/24)為陽性，認為Lunx是1種特異性好、敏感度高的腫瘤標志物。

以TaqMan熒光標記探針為基礎的FQ-PCR技術是在常規PCR技術的基礎上運用熒光能量傳遞(Fluorescence resonance energy transfer,FRET)技術，加入熒光標記探針，即在其5’端標記6-羧基熒光素(FAM)和在3’端標記6-羧基-四甲基羅丹明(TAMRA)，將核酸擴增、雜交、光譜分析和實時檢測技術結合起來，利用熒光信號來檢測PCR產物，是目前應用較為廣泛的基因定量檢測方法[9]。巢式PCR是針對同一靶核酸設計一對外引物和一對內引物，先用外引物進行擴增，再用內引物擴增，提高了PCR檢測的敏感性。

本研究采用巢式FQ-RT-PCR技術，通過檢測非小細胞肺癌組、肺良性疾病組和健康對照組外周血的Lunx mRNA的表達及分析非小細胞肺癌疾病組Lunx mRNA的表達與各臨床特征的關系，研究Lunx mRNA作為NSCLC微轉移的分子標志物的可行性。結果顯示非小細胞肺癌患者組Lunx mRNA檢測陽性率為56%，NSCLC組與2個對照組的差異均有統計學意義，與文獻相符[10～14]。同時，lunx mRNA的表達與肺癌的分期明顯相關，與年齡、性別、病理分型等無明顯相關，與文獻相符[13,14]。以上結果提示肺癌患者外周血中lunx mRNA的表達來自于轉移的癌細胞，而在肺良性疾病和健康人外周血、淋巴結中均未檢測到lunx mRNA的表達，表明lunx mRNA作為肺癌轉移檢測分子標志物具有很好的特異性和敏感性。以上研究提示lunx mRNA是肺癌微轉移檢測敏感特異的分子標志物，而微轉移的檢出表明腫瘤具有很高的轉移傾向，對臨床分期、判斷預后和確定手術及術后治療起到指導作用。血液、淋巴結中檢測到少量癌細胞并非最終一定形成顯性轉移，癌細胞自身生物學特性、機體免疫狀況、局部微環境都是重要的影響因素。通過隨訪，以進一步明確微轉移與復發、轉移及預后的關系。

[1]Osaki T,Oyama T,Gu CD,et al.Prognostic impact of micrometastatic tumor cells in the lymph nodes and bone marrow of patients with completely resected stage I non--small- cell lung cancer〔J〕.J Clin Oncol，2002，20(13)：2930.

[2]劉德林，朱廣迎，王 緒.肺癌微轉移的檢測及臨床意義〔J〕.中國肺癌雜志，2001，4(2)：121.

[3]Iwao K，Watanabe T，Fujiwara Y，et al.Isolation of a novel human lung specific gene，Lunx，a potential molecular marker for detection of micrometastasis in non small cell lung cancer〔J〕.Int J Cancer，2001，91(2)：433.

[4]Giamieri E，Dc Francersco GP，Carico E，et al.Detection，characterization and clinical significance of circulating cancer cells in patients surgically treated for breast cancer〔J〕.Chic，2004，25(5)：194.

[5]顧 科，張軍寧.非小細胞肺癌微轉移研究現狀〔J〕.實用癌癥雜志,2005,20(4)：437.

[6]公雪慧，鄔 蒙.非小細胞肺癌微轉移檢測及其臨床意義〔J〕.實用癌癥雜志,2005,20(5)：553.

[7]吳一龍.肺癌多學科綜合治療的理論基礎〔M〕.北京：人民衛生出版社，2000：1～17.

[8]Mitas M，Hoover L，Silvestrl G，et al.Lunx is a superior molecular marker for detection of non-small cell lung cancer in peripheral blood〔J〕.J Mol Diagn，2003，5(4)：237.

[9]李金明.實時熒光PCR技術〔M〕.北京：人民軍醫出版社，2007：17.

[10]吳 昊,李 滸,章希賢.非小細胞肺癌患者外周血和骨髓中Lunx基因表達的臨床意義〔J〕.中國腫瘤,2006,15(5):329.

[11]宋 萍,李 堅,殷凱生.檢測外周血Lunx mRNA表達對于診斷肺癌微轉移的臨床價值〔J〕.江蘇大學學報(醫學版)，2006，16(4):304.

[12]朱廣迎，劉德林，王 緒.等.lunx mRNA RT-PCR 檢測肺癌的微轉移〔J〕.中國腫瘤臨床，2003，30(2)：124.

[13]劉 靜，榮 福.NSCLC外周血、區域淋巴結微轉移檢測對術前分期的臨床價值〔J〕.現代腫瘤醫學，2010，3 ：491.

[14]劉宏偉，謝 風，劉 剛.等.RT-PCR法檢測非小細胞肺癌患者外周血 Lunx mRNA的表達及臨床意義〔J〕.中國實驗診斷學,2008,12(8)：905.