合成生物學(xué)在醫(yī)藥領(lǐng)域中的應(yīng)用

馮嬌，何珣，陳怡露

(南京工業(yè)大學(xué)生物與制藥工程學(xué)院，江蘇南京 210009)

1 醫(yī)藥行業(yè)的發(fā)展現(xiàn)狀

中國是世界第一大原料藥生產(chǎn)國和出口國、世界第二大非處方(OTC)藥物市場［1］。國際知名醫(yī)藥健康咨詢公司 IMS Health Inc．的統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)［2］顯示，目前我國已成為繼日本之后的全球第三大醫(yī)藥市場。

據(jù)統(tǒng)計(jì)，目前美國已有1 300多家的生物技術(shù)企業(yè)，約占世界總量的2/3;生物技術(shù)市場資本總額超過了400億美元，每年的科研經(jīng)費(fèi)超過了50億美元［3］;已經(jīng)成功研發(fā)出30多個(gè)重要的治療藥物，正式投放市場的藥物也達(dá)到了40多個(gè);日本已有65%的生物技術(shù)公司從事于生物醫(yī)藥研究［4］。在我國生物醫(yī)藥產(chǎn)業(yè)近年來一直保持著較高的增長速度，從事生物技術(shù)產(chǎn)業(yè)和相關(guān)產(chǎn)品研發(fā)的公司、大學(xué)和科研院所達(dá)600余家，注冊的生物醫(yī)藥公司有200余家［5］。同時(shí)在我國生物制藥的利潤率達(dá)11%，超出行業(yè)平均利潤率 2%［1］。

醫(yī)藥制造產(chǎn)業(yè)是一個(gè)朝陽產(chǎn)業(yè)，現(xiàn)在醫(yī)藥的需要量越來越大，而醫(yī)藥制造的技術(shù)含量相當(dāng)高，在醫(yī)藥企業(yè)的競爭較量中，科學(xué)技術(shù)實(shí)力往往是關(guān)鍵性因素，所以，對于醫(yī)藥企業(yè)而言，技術(shù)創(chuàng)新具有更特殊的意義。近年來，合成生物學(xué)這門學(xué)科的出現(xiàn)和發(fā)展可為醫(yī)藥產(chǎn)業(yè)的技術(shù)帶來新一輪的創(chuàng)新和提高。

2 合成生物學(xué)概況

2． 1 合成生物學(xué)概念及其研究內(nèi)容

合成生物學(xué)是一門新興的交叉學(xué)科，2010年5月生物學(xué)家克雷格．文特爾、漢密爾頓．史密斯等在世界著名權(quán)威學(xué)術(shù)期刊《科學(xué)》上宣布他們通過化學(xué)合成方法成功合成了人類歷史上首個(gè)“人造細(xì)胞生物”——完整的細(xì)菌染色體 Mycoplasmamycoide，并將其成功轉(zhuǎn)移到了另一種與其親緣關(guān)系很近的，并且去除原基因組的山羊支原體細(xì)胞內(nèi)［6］。這一研究成果使得合成生物學(xué)受到了前所未有的關(guān)注，成為現(xiàn)代生命科學(xué)的研究熱點(diǎn)。

合成生物學(xué)是以生命科學(xué)理論為指導(dǎo)，以工程學(xué)原理進(jìn)行遺傳設(shè)計(jì)、基因組改造(重組染色體)和(或)合成(包括賦予各種復(fù)雜生物功能為單位的基因群模塊合成、模塊組裝)以及人造細(xì)胞合成，它們能在從分子到細(xì)胞、從組織到機(jī)體的多個(gè)水平上參與包括遺傳與進(jìn)化在內(nèi)的復(fù)雜生物學(xué)［7］，這是一門涉及微生物學(xué)、分子生物學(xué)、遺傳工程、材料科學(xué)以及計(jì)算科學(xué)等多個(gè)領(lǐng)域的綜合性交叉學(xué)科［8］。

作為一門前沿學(xué)科，合成生物學(xué)不同于以往的代謝工程及系統(tǒng)生物學(xué)。代謝工程著眼于宿主細(xì)胞已有代謝途徑的敲除和(或)過量表達(dá)以實(shí)現(xiàn)代謝網(wǎng)絡(luò)的定向優(yōu)化，以及對底物轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白和產(chǎn)物轉(zhuǎn)運(yùn)過程的修飾。系統(tǒng)生物學(xué)是從基因組規(guī)模去全面理解細(xì)胞的代謝網(wǎng)絡(luò)，包括組成代謝途徑的結(jié)構(gòu)基因、細(xì)胞代謝復(fù)雜的調(diào)節(jié)機(jī)制以及遺傳和環(huán)境擾動對細(xì)胞全局代謝的影響，從而建立組學(xué)規(guī)模的代謝模型，對可能的基因工程操作效果進(jìn)行評價(jià)和預(yù)測，并通過對基因工程操作后獲得的菌株的代謝網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行分析［9］。而合成生物學(xué)則著眼于從頭設(shè)計(jì)全新的代謝途徑或全新的生命系統(tǒng)，同時(shí)也可以通過模塊的優(yōu)化和重建改造原有的生命系統(tǒng)。可以說合成生物學(xué)需要在系統(tǒng)生物學(xué)了解到的生物的基礎(chǔ)上，應(yīng)用以基因組技術(shù)為核心的生物技術(shù)，綜合多種學(xué)科來設(shè)計(jì)、改造、重建或制造生物分子、生物體部件、生物反應(yīng)系統(tǒng)、代謝途徑與過程乃至整個(gè)生命活動的細(xì)胞和生物個(gè)體。

目前合成生物學(xué)主要有兩個(gè)基本方向:一個(gè)是創(chuàng)造簡單的生命形式，比如最簡單的病毒和細(xì)菌，利用非天然的分子再現(xiàn)自然生物體的天然特性;另一個(gè)是分離自然生物體中的一部分并將其重構(gòu)到具有非天然機(jī)能的生物系統(tǒng)當(dāng)中來改造生命的過程或形式。

合成生物學(xué)的基本研究思路是利用生物零件(parts)，如啟動子、核糖體結(jié)合位點(diǎn)、核糖核酸(RNA)、酶編碼基因等組裝成裝置(devices)，即代謝途徑或調(diào)解環(huán)路，并將裝置進(jìn)一步組建成生命系統(tǒng)(systems)，包括根據(jù)人類的意愿從頭設(shè)計(jì)合成新的生命過程或生命體，以及對現(xiàn)有生物體進(jìn)行重新設(shè)計(jì)［10］。

2． 2 合成生物學(xué)發(fā)展進(jìn)程

1911年7月8日，在著名醫(yī)學(xué)刊物《柳葉刀》發(fā)表的一篇書評中合成生物學(xué)一詞首次出現(xiàn)［11］，而“合成生物學(xué)”作為一個(gè)新概念，是由波蘭遺傳學(xué)家Waclaw Szybalski在1974年首先提出的。他指出分子生物學(xué)的發(fā)展必將最終發(fā)展到合成生物學(xué)階段，屆時(shí)人們將可以設(shè)計(jì)新的控制元件，利用他們改造自然界的基因組，甚至可以從頭構(gòu)建全新的基因組［12］。之后，在1980年第一次以“基因外科術(shù):合成生物學(xué)的開始”為題的一篇長篇論文出現(xiàn)在德文刊物［13］。自從2000年Kool在美國化學(xué)學(xué)會年會上重新提出合成生物學(xué)概念，其定義為基于系統(tǒng)生物學(xué)的遺傳工程，從基因片段、人工堿基DNA分子、基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)與信號傳導(dǎo)路徑到細(xì)胞的人工設(shè)計(jì)與合成，類似于現(xiàn)代集成型建筑工程，將工程學(xué)原理與方法應(yīng)用于遺傳工程與細(xì)胞工程等生物技術(shù)領(lǐng)域，合成生物學(xué)、計(jì)算生物學(xué)與化學(xué)生物學(xué)一同構(gòu)成系統(tǒng)生物技術(shù)的方法基礎(chǔ)。有研究人員［14］以“合成生物學(xué)的初次登臺”為題對此作了長篇報(bào)道，自此以來，細(xì)胞信號傳導(dǎo)、基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)設(shè)計(jì)與轉(zhuǎn)基因研究開發(fā)迅速發(fā)展。

2000年1月《自然》上發(fā)表了2篇文章:Gardner等［15］在大腸桿菌中構(gòu)建了基因開關(guān)(toggle switch)，一個(gè)合成的雙穩(wěn)態(tài)基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò);Elowitz等［16］構(gòu)建了第一個(gè)合成的生物振蕩器——壓縮振蕩子(repressilator)。這兩篇論文標(biāo)志著合成生物學(xué)作為一個(gè)新的領(lǐng)域正式產(chǎn)生。2002年，Wimmer小組［17］制造了歷史上第一個(gè)人工合成有生物活性的脊髓灰質(zhì)炎病毒基因組，這一工作開創(chuàng)了以無生命的化合物合成感染性病毒的先河。2003年文特爾小組合成了φX174噬菌體基因組［18］，2004年6月在美國麻省理工學(xué)院舉行了第一屆合成生物學(xué)國際會議。2005年8月，在美國舊金山舉行的合成生物學(xué)會議討論了生物合成這一領(lǐng)域?qū)λ幬锇l(fā)展、細(xì)胞重編程、生物機(jī)器人等方面的潛在意義。2005年在美國創(chuàng)建了Cellincon合成生物公司，同年麻省理工學(xué)院的Endy［19］明確提出工程中常用的“標(biāo)準(zhǔn)化”、“復(fù)雜系統(tǒng)解耦”、“概念抽象化”做法，并清楚地將合成生物學(xué)涉及的生物系統(tǒng)分成DNA、部件、裝置、系統(tǒng)4個(gè)層次。之后隨著合成生物學(xué)的發(fā)展及影響，美國學(xué)者Endy等人于2005年在國際遺傳工程機(jī)器大賽［20］中創(chuàng)立了標(biāo)準(zhǔn)化的生物模塊BioBrick登記處，收集各種標(biāo)準(zhǔn)化的生物零件，這充分證明了合成生物學(xué)在設(shè)計(jì)模塊中的發(fā)展。

2006年以來，合成生物學(xué)發(fā)展又進(jìn)入了新階段，研究主流從單一生物部件的設(shè)計(jì)快速發(fā)展到對多種基本部件和模塊進(jìn)行整合。通過設(shè)計(jì)多部件之間的協(xié)調(diào)運(yùn)作建立復(fù)雜的系統(tǒng)，并對代謝網(wǎng)絡(luò)流量進(jìn)行精細(xì)調(diào)控，從而構(gòu)建人工細(xì)胞行為來實(shí)現(xiàn)藥物、功能材料與能源替代品的大規(guī)模生產(chǎn)。2007年，加州大學(xué)伯克利校園首創(chuàng)了合成生物學(xué)系。

2010年1月，《細(xì)胞》和《自然》［21-22］同時(shí)為合成生物學(xué)創(chuàng)建10周年發(fā)表專題社論。2010年5月，文特爾成功地將人工合成的支原體基因組轉(zhuǎn)入到除原基因組的山羊支原體細(xì)胞內(nèi)，獲得了具有自我復(fù)制和生存能力的新菌株［6］，制造出了第一個(gè)具有人造基因組的活細(xì)胞。這在合成生物學(xué)的發(fā)展史中具有里程碑的意義，顯示了合成生物學(xué)的可行性和應(yīng)用性。

3 合成生物學(xué)在醫(yī)藥行業(yè)的應(yīng)用

合成生物學(xué)在醫(yī)藥領(lǐng)域已具有很多應(yīng)用，這些方面包括更有效疫苗的生產(chǎn)、新藥和改進(jìn)的藥物、可以進(jìn)行檢測的生物傳感器等。隨著合成生物學(xué)的逐漸成熟以及它在醫(yī)藥領(lǐng)域應(yīng)用的深入，合成生物學(xué)也必將極大地促進(jìn)整個(gè)生物醫(yī)藥領(lǐng)域的發(fā)展。

3． 1 合成生物學(xué)降低醫(yī)藥的成本

合成生物學(xué)在醫(yī)藥領(lǐng)域的應(yīng)用最典型的例子莫過于Keasling合成抗瘧疾藥物青蒿素的經(jīng)典工作。瘧疾每年大約會感染5億世界上最貧困的人，并且致使其中多達(dá)100萬人喪生，喪生者多數(shù)是5歲以下的兒童。幾個(gè)世紀(jì)以來，標(biāo)準(zhǔn)的治療方法是使用奎寧，或者是其衍生物氯喹，但因長期使用和病原體抗藥性的增強(qiáng)而使其療效一降再降。青蒿素由于可以高效殺死瘧疾寄生蟲，因此是目前最有效的抗瘧疾藥物之一。天然的青蒿素是在青蒿(artemisia annua)中提取，但是產(chǎn)量十分稀少，提取工藝復(fù)雜，提取成本極其昂貴——植物提取成本約為奎寧的10倍，供應(yīng)量無法滿足世界各地患者的需要。目前使用青蒿素進(jìn)行治療每個(gè)療程的費(fèi)用是8美元到15美元，而大部分患者均處于世界上最貧困的地區(qū)，無法負(fù)擔(dān)昂貴的藥費(fèi)。美國UCB化學(xué)工程系教授、勞倫斯國家實(shí)驗(yàn)室合成生物學(xué)中心主任Keasling意識到如果合理利用合成生物學(xué)的工具，就可以完全不受自然條件控制，將每一個(gè)細(xì)胞當(dāng)作微生物制藥工廠進(jìn)行設(shè)計(jì)、加工、集成、組裝、控制等而生產(chǎn)出青蒿素，那么就不再需要繁復(fù)且成本很高的生產(chǎn)過程了。之后，Keasling［23-24］在大腸桿菌、酵母中對青蒿基因及其代謝途徑進(jìn)行了設(shè)計(jì)組裝與精密調(diào)控的研究。

2003 年，Keasling［24］在大腸桿菌中生產(chǎn)青蒿素的思路主要如圖1。首先是將大腸桿菌中乙酰輔酶A轉(zhuǎn)化成甲羥戊酸;再將甲羥戊酸轉(zhuǎn)化成異戊烯焦磷酸酯(IPP)或者二甲(基)丙烯焦磷酸酯(DMAPP);之后將IPP或DMAPP轉(zhuǎn)化成法尼基環(huán)焦磷酸酯(FPP)，最后利用青蒿中的ADS基因，將FPP轉(zhuǎn)化成青蒿酸合成前體amorphadiene。

圖1 大腸桿菌生產(chǎn)青蒿素示意圖Fig 1 Producing artemisinic acid in Escherichia Coli

Keasling將大腸桿菌通過植物青蒿的amorphadiene合成酶(ADS)密碼子優(yōu)化、共表達(dá)SOE4操縱子(編碼DXS、IPPHp、IspA)以及引入異源的酵母菌甲羥戊酸途徑，協(xié)調(diào)IPP有關(guān)的基因以平衡其合成與消耗，確保在其能夠殺傷大腸桿菌以前及時(shí)轉(zhuǎn)化為Amorphadiene，從而提高了amorphadiene的產(chǎn)量。

2006 年，keasling［25］在酵母菌中生產(chǎn)青蒿素的思路主要如圖2。通過優(yōu)化FPP生物合成途徑提高FPP的產(chǎn)量;從青蒿中引入ADS基因，其表達(dá)的產(chǎn)物將FPP轉(zhuǎn)化為Amorphadiene;通過比較基因組學(xué)分析得到來自于青蒿的細(xì)胞色素P450氧化還原酶CYP71AV1/CPR，克隆表達(dá)后實(shí)現(xiàn);Amorphadiene通過三步氧化還原反應(yīng)得到青蒿素前體——青蒿酸。

圖2 酵母菌生產(chǎn)青蒿素示意圖Fig 2 Producing artemisinic acid in Yeast

Keasling的主要工作是改造FPP合成途徑——過量表達(dá)tHMGR，有效限制FPP向固醇的轉(zhuǎn)化;通過甲硫氨酸可抑制啟動子(PMET3)下調(diào)ERG9編碼的角鯊烯(squalene)合成酶活性，阻斷FPP向下合成固醇的支路，避免FPP在其他方面的不必要消耗;引入植物青蒿的amorphadiene合成酶(ADS)基因，克隆青蒿類植物轉(zhuǎn)化amorphadiene為青蒿酸的細(xì)胞色素P450氧化還原酶等。他們利用酵母天然的甲羥戊酸途徑，該途徑在正常情況下通過糖類代謝產(chǎn)生乙酰輔酶A來合成甾醇;而在他們所合成的代謝途徑中，甲羥戊酸途徑被用來大量產(chǎn)生中間體FPP，而FPP接下來可被在酵母中表達(dá)的ADS和CYP71AV1催化產(chǎn)生青蒿素前體——青蒿酸。

Keasling利用合成生物學(xué)的手段，首先設(shè)計(jì)了一條在大腸桿菌或酵母中不存在的合成青蒿酸的途徑，在利用微生物自身已有的代謝途徑的前提下引入外源模塊，再將來自大腸桿菌、酵母、青蒿多種基因及其代謝途徑組裝與精密調(diào)控，最后執(zhí)行所需功能的途徑生產(chǎn)出青蒿酸，最終實(shí)現(xiàn)了他將每一個(gè)細(xì)胞當(dāng)作微生物制藥工廠進(jìn)行設(shè)計(jì)、加工、集成、組裝、控制等，從而生產(chǎn)出青蒿素的想法。

通過上面的研究，利用大腸桿菌及酵母細(xì)胞合成青蒿素前體——青蒿酸的能力提高了100萬倍，使得每一劑量的藥品成本從10美元左右下降到了不到1美元。為表彰Keasling的杰出成就，Keasling被美國發(fā)現(xiàn)雜志評選為2006年最有影響的科學(xué)家［25］，并獲得了Bill and Melinda Gates基金資助高達(dá)4 000萬美金的研究資金，用于產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)青蒿素。

3． 2 合成生物學(xué)治療疾病

通過合成生物學(xué)的手段對疾病治療也能起到幫助作用，主要是由于構(gòu)建出能夠幫助基因治療的工程細(xì)胞。合成生物學(xué)還可以對細(xì)菌或者病毒的生物學(xué)特性進(jìn)行改造，主要是改造對這些細(xì)菌或者病毒具有能夠識別和浸染特定的細(xì)胞可引發(fā)毒害作用的生物學(xué)特性，使其失去致病性并且具有能夠識別機(jī)體惡性細(xì)胞的新特性。之后利用這些改造后的細(xì)菌或者病毒來傳遞治療藥物，這對癌癥和其他相關(guān)疾病的治療會具有更好的作用。

一個(gè)殺死癌細(xì)胞的細(xì)菌應(yīng)該能感覺到腫瘤環(huán)境，并能對其作出應(yīng)答，一旦進(jìn)入到腫瘤內(nèi)，細(xì)菌必須滲入癌細(xì)胞，接著就開始產(chǎn)生殺腫瘤的毒素。美國加州大學(xué)的Voigt等［26］設(shè)計(jì)了一種可以侵入并殺死癌細(xì)胞的細(xì)菌，他們向細(xì)菌中引入了多個(gè)模塊化零件，包括兩個(gè)探測器、一個(gè)“與門”控制器、一個(gè)反應(yīng)器，使得細(xì)菌可以探測外界的環(huán)境。當(dāng)細(xì)菌處于低氧環(huán)境、且細(xì)菌的密度超過一定閾值時(shí)(這兩者都是只有在腫瘤細(xì)胞中才有的特征)，細(xì)菌將表達(dá)透明質(zhì)酸酶(invasin)，從而殺死癌細(xì)胞。由于這些模塊可以與其他同類型零件進(jìn)行替換，使得人們可以設(shè)計(jì)出針對特定癌細(xì)胞的特異性治療的細(xì)菌，這個(gè)充分顯示了合成生物學(xué)的靈活性。

3． 3 合成生物學(xué)生產(chǎn)醫(yī)用生物材料及檢測病毒

基于合成生物學(xué)的分子機(jī)器設(shè)計(jì)和合成，結(jié)合多種學(xué)科，通過設(shè)計(jì)、改造和合成獲得高活性和高穩(wěn)定性等特殊要求的重要材料，可以進(jìn)一步生產(chǎn)重要的以生物為基礎(chǔ)的產(chǎn)品，從而獲得滿足醫(yī)用的特殊性能材料。

除此之外，合成生物學(xué)可用于構(gòu)建微生物或其他生物，對毒素、化學(xué)品、其他病原微生物進(jìn)行監(jiān)測，以使發(fā)現(xiàn)新傳染物及病毒，從而極大可能地幫助新發(fā)傳染病的早期監(jiān)測及控制［27-28］。

通過以上一些應(yīng)用可以看出，合成生物學(xué)可以通過合理的設(shè)計(jì)和構(gòu)造代謝途徑來調(diào)節(jié)生物體內(nèi)復(fù)雜的代謝、調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，從而優(yōu)化能源和資源的應(yīng)用，以及提高目標(biāo)產(chǎn)物。運(yùn)用一些合成生物學(xué)的工具——如啟動子文庫、RNA控制元件、感應(yīng)控制裝置、蛋白質(zhì)降解標(biāo)簽等［29-31］可以做到動態(tài)地改變代謝途徑中關(guān)鍵酶的水平;合成生物學(xué)的出現(xiàn)使我們可以將其他非傳統(tǒng)微生物中新型未發(fā)現(xiàn)的酶經(jīng)過進(jìn)化和設(shè)計(jì)改造后，篩選出性能優(yōu)良的酶整合到設(shè)計(jì)的途徑中，從而優(yōu)化代謝。由于合成生物學(xué)的優(yōu)勢，在未來建構(gòu)更多的合成生物學(xué)工具會被應(yīng)用于醫(yī)藥的研究中。

4 結(jié) 語

合成生物學(xué)通過構(gòu)筑人工生物系統(tǒng)來更好地理解和改造天然生物系統(tǒng)的工作原理，使它無論從科學(xué)或技術(shù)兩方面來看都占有重要的地位。隨著合成生物學(xué)的飛速發(fā)展，同樣也帶來了一些問題，如合成生物學(xué)高昂的研究費(fèi)用、生物安全、倫理及知識產(chǎn)權(quán)等問題［32-35］。發(fā)展與問題一向是同在的，如何把握在于我們。相信隨著合成生物學(xué)的不斷成熟，一些問題將會迎刃而解。

醫(yī)藥行業(yè)雖說已經(jīng)飛速發(fā)展，但仍存在許多阻礙，例如某些藥物生產(chǎn)成本高昂、某些疾病沒有治療方法、制藥企業(yè)帶來的嚴(yán)重的環(huán)境污染等。如今，合成生物學(xué)的發(fā)展使得我們可以以合成生物學(xué)相關(guān)技術(shù)方法為主體，結(jié)合已有的學(xué)術(shù)基礎(chǔ)和研究資源解決我國目前和未來面臨的嚴(yán)峻的醫(yī)藥問題，并帶動整個(gè)醫(yī)藥領(lǐng)域的發(fā)展。可以預(yù)見，合成生物學(xué)研究的不斷成熟，醫(yī)藥領(lǐng)域的更多方面將被涉及，更高效的生產(chǎn)宿主將成功構(gòu)建，生物醫(yī)藥生產(chǎn)過程的經(jīng)濟(jì)性也將得到明顯提高，從而使生物醫(yī)藥能得到更廣泛的生產(chǎn)和應(yīng)用。

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