TDG變體的構建、表達、純化及其DNA修復功能研究

林小偉，華子春

(南京大學醫藥生物技術國家重點實驗室，江蘇南京 210093)

DNA存儲著生命體賴以生存和繁衍的遺傳信息， 維持DNA的完整性對于生命體來說至關重要［1］。然而，外界環境和生命體內在因素經常會造成DNA的損傷或改變，例如水解作用和化學因素等，尤其水解反應發生的概率很高，包括堿基(如C、5-meC、A和G)的脫氨基作用。C和5-meC脫氨基分別生成U和T，從而與G配對形成G:U和G:T錯配。除非錯配被修復，否則將增加G:C向T:A的突變轉移從而導致DNA變異［2-5］。因此，DNA錯配是一種常見的DNA變異形式，DNA的這種變異主要是通過堿基切除修復(BER)系統來修復的，而其中DNA糖苷酶就是用來修復DNA錯配的蛋白家族之一［6］。

胸腺嘧啶糖苷酶(TDG)是尿嘧啶糖苷酶(UDG)超家族的重要一員，它既具有修復5-甲基胞嘧啶自發水解脫氨基產生的G:T錯配的能力，也具有像其他尿嘧啶糖苷酶家族一樣具有修復G:U錯配的能力［7-8］。此外，有不少研究發現TDG不僅僅具有DNA錯配修復功能，還與基因表達調控、CPG島甲基化調控、胚胎發育以及腫瘤的發生與治療等都有密切關系。此前就有不少文獻報道，TDG能通過多種方式抑制腫瘤的發生。其中，TDG作為UDG家族的一員就介導了5-FU、FdUrd等化療藥物治療腫瘤的代謝過程［9］。此外，也有文獻報道TDG的G:T錯配修復功能也可能與化療相關［10-11］。本實驗室近年來圍繞TDG的結構與功能關系開展了系列研究［12-14］，而本研究主要著眼于TDG修復G:U錯配的結構與功能關系研究，以期為以后的生物學功能研究奠定基礎。

1 材料與方法

1． 1 實驗材料與試劑

原核表達載體pET28a(+)購自Novagen公司，大腸桿菌E coli克隆菌株Top10及表達菌株BL21(DE3)由本實驗室保存。PCR試劑、限制性內切酶XhoⅠ和NdeⅠ、Taq DNA Polymerase、T4DNA Ligase、Pyrobest DNA聚合酶均購自TaKaRa公司。柱離心式質粒小提試劑盒和柱離心式膠回收小提試劑盒購自上海申能博彩公司。

1． 2 實驗方法

1．2.1 PCR擴增mTDG的C-端截短基因片段mTDG

(1-279) 以載體pCI-HA-TDG為模板，用高保真酶

Pyrobest DNA聚合酶PCR擴增只含有編碼1-279位氨基酸殘基的基因片段，即mTDG(1-279)(圖1)。所用的上下游引物分別為:

在上游引物中有NdeⅠ酶切位點(斜黑體下劃線)，下游引物中有XhoⅠ的酶切位點(斜黑體下劃線)。PCR反應條件為:94℃熱變性30 s，60℃退火30 s，72℃延伸1 min，共進行26個循環。對PCR產物行DNA瓊脂糖凝膠電泳分離，切膠回收。

圖1 mTDG蛋白及mTDG(1-279)蛋白的結構Fig 1 Schematic overview of the domain structure of mTDG and mTDG(1-279)

1．2.2 構建重組質粒pET28a-mTDG(1-279) 將回收得到的基因片段mTDG(1-279)經NdeⅠ和XhoⅠ雙酶切3 h后，并經瓊脂糖凝膠電泳分離且回收后插入到同樣經NdeⅠ和XhoⅠ雙酶切回收的pET28a(+)載體中。用T4DNA Ligase連接，16℃過夜反應，連接產物轉化Top10感受態細胞，熱擊、活化，涂布于含有Kan+抗生素的LB平板上，37℃倒置培養12 h。挑取單菌落進行菌落PCR篩選陽性克隆，并經NdeⅠ和XhoⅠ雙酶切鑒定以及DNA測序，分析其閱讀框和編碼序列的正確性。

1．2.3 His-mTDG(1-279)蛋白的表達與純化 構建好的重組質粒pET28a-mTDG(1-279)轉化表達菌株BL21(DE3)，挑取單克隆到含 60 μg·ml－1卡那霉素的3 ml LB液體培養基過夜活化培養，然后按1∶100的比例轉接入 300 ml含60 μg·ml－1卡那霉素的 LB 液體培養基中，先37℃培養3 h左右至菌液濃度OD600nm=0.7～0.9時，再將培養瓶冷卻至20℃，然后加入IPTG到終濃度為0.2 mmol·L－1誘導表達，16 h后收集菌體，超聲裂解 20 min(脈沖 3 s，間隔 3 s)，12 000 r·min－1離心 10 min。將收集的上清以 0.5 ml·min－1的速率加載到已經用Tris-HCl緩沖液預平衡過的Ni+親和柱上，上完樣后用Tris-HCl緩沖液充分洗滌至基線，再用含有50 mmol·L－1咪唑的緩沖液洗滌雜蛋白，最后用含250 mmol·L－1咪唑的緩沖液洗脫目的蛋白。再將通過 Ni+親和柱純化的洗脫蛋白立即使用Sephadex G15凝膠柱層析去除咪唑。純化后的蛋白加入10%的甘油后，保存在－80℃備用。

1．2.4 mTDG(1-279)蛋白對G/U錯配修復的體外活性分析 mTDG(1-279)蛋白的活性分析參照文獻［12］進行，首先在U-44(5'-AATTGGGCTCCTCGAGGAATTU GCCTTCTGCAGGCATGCCCCGG-3')的5'端帶上 ROX熒光標記(由Invitrogen公司合成)，然后與G-44(5'-C CGGGGCATGCCTGCAGAAGGCGAATTCCTCGAGGAGC CCAATT-3')配對退火形成含有U:G錯配的異源雙鏈，即用于測活的底物。測活反應體系為:50 mmol·L－1Tris-HCl(pH 8.0)，1 mmol·L－1DTT，50 μg·ml－1BSA，1 mmol·L－1EDTA，3%甘油，含有 U:G 錯配的雙鏈底物0.3 mmol·L－1和適量的 mTDG(1-279)蛋白，10 μl反應體系。先在37℃水浴反應30 min，再加入1．1 μl 1 mol·L－1NaOH，90 ℃反應 30 min 后，迅速置冰上5 min，短暫離心后，加入5 μl測活loading(90%formamide，10 mmol·L－1EDTA，0.1%xylene cyanol，0.1%bromophenol blue)。最后取10 μl混合物上樣，在14%聚丙烯酰胺測序膠進行電泳分離，電泳完畢后用Typhoon 9410 workstation(Amersham公司)進行掃描與分析。

2 結 果

2． 1PCR 擴增mTDG(1-279)基因片段

按標準反應體系及以上條件PCR擴增得到mTDG(1-279)基因片段，PCR產物用DNA瓊脂糖凝膠電泳進行分離，結果顯示大小正確(837 bp，圖2)，之后切膠并回收。

圖2 mTDG(1-279)的PCR擴增產物Fig 2 The PCR product of gene encoding mTDG(1-279)

2． 2 重組質粒pET28a-mTDG(1-279)的構建

mTDG(1-279)片段經PCR擴增、酶切，然后與酶切過的pET28a(+)表達載體連接，轉化Top10感受態細胞，挑取克隆經菌落PCR鑒定、雙酶切鑒定(圖3)，最后通過DNA測序分析證明mTDG(1-279)片段已成功插入載體中，其閱讀框序列保持一致。

2． 3His-mTDG(1-279)的表達及純化

［14］中TDG表達純化的條件，我們確定了表達His-mTDG(1-279)條件，就是在低溫20℃和低IPTG濃度0.2 mmol·L－1時，能夠很好地表達且大部分在可溶上清里。我們通過Ni+柱親和純化及使用Sephadex G15凝膠柱層析去除咪唑后，用12%SDSPAGE膠電泳檢測蛋白表達情況(圖4)，可知獲得了比較單一條帶的His-mTDG(1-279)融合蛋白。此外，用Bradford法測純化得到的蛋白濃度，可以有37 mg·L－1的得率，可用于體外測活。

圖3 重組質粒pET28a-mTDG(1-279)的酶切鑒定分析Fig 3 Identification of pET28a-mTDG(1-279)by restriction endonuclease digestion

圖4 mTDG(1-279)蛋白表達純化的SDS-PAGE分析Fig 4 SDS-PAGE analysis of the expression and purification of mTDG(1-279)protein

2． 4 G:U錯配修復的體外活性分析

參考經典的TDG體外測活實驗以及經我們改進過的測活方法，將純化的mTDG(1-279)蛋白與含有G:U錯配的異源雙鏈混合反應，并進行分析，結果顯示mTDG(1-279)蛋白能使異源雙鏈斷裂產生產物，即表明mTDG(1-279)蛋白具有良好的U:G錯配修復活性(圖5)。

3 討 論

胸腺嘧啶糖苷酶是一個重要的DNA糖苷酶，它主要修復5-甲基胞嘧啶自發水解脫氨基產生的G:T錯配，但同時它又具有修復G:U錯配的能力。從以前的研究得知，它的錯配修復功能與腫瘤治療有密切關系。近年來，國際上對TDG其他功能的研究也取得了長足的發展。例如TDG缺陷型或TDG失活的胚胎無法發育成功會壞死，表明TDG在維持表觀遺傳穩定方面起著重要的作用［15-16］。近年來，本研究室圍繞TDG的結構與功能關系展開了深入研究。在之前的研究中，我們已經就TDG抗體的制備、活性測定的改進、G:T錯配的體外、體內測活及其功能等方面展開了深入的研究。

圖5 mTDG(1-279)蛋白修復G:U錯配的活性分析Fig 5 The activity assay of mTDG(1-279)protein

mTDG由421個氨基酸殘基組成，此前文獻報道其維持G:T錯配修復的活性結構域為67-374位氨基酸，維持G:U錯配修復的活性結構域為123-374位氨基酸［7，17-19］(如圖1 所示)，但是這只是粗略地界定而沒有被具體精確地界定。在本研究中，我們通過構建mTDG的C-端截短變體mTDG(1-279)，經表達、純化，獲得了mTDG(1-279)變體蛋白，并進行了G:U錯配修復活性分析。實驗結果表明mTDG(1-279)仍然具有良好的G:U錯配修復活性。因此，我們發現其維持G:U錯配修復的活性結構域應該在1-279位氨基酸的更小范圍，此外我們可以借助該方法精確地定位出TDG修復G:U錯配的活性結構域，為后期的生物學功能研究打好基礎。

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