TDG變體的構(gòu)建、表達(dá)、純化及其DNA修復(fù)功能研究

林小偉，華子春

(南京大學(xué)醫(yī)藥生物技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇南京 210093)

DNA存儲(chǔ)著生命體賴以生存和繁衍的遺傳信息， 維持DNA的完整性對(duì)于生命體來說至關(guān)重要［1］。然而，外界環(huán)境和生命體內(nèi)在因素經(jīng)常會(huì)造成DNA的損傷或改變，例如水解作用和化學(xué)因素等，尤其水解反應(yīng)發(fā)生的概率很高，包括堿基(如C、5-meC、A和G)的脫氨基作用。C和5-meC脫氨基分別生成U和T，從而與G配對(duì)形成G:U和G:T錯(cuò)配。除非錯(cuò)配被修復(fù)，否則將增加G:C向T:A的突變轉(zhuǎn)移從而導(dǎo)致DNA變異［2-5］。因此，DNA錯(cuò)配是一種常見的DNA變異形式，DNA的這種變異主要是通過堿基切除修復(fù)(BER)系統(tǒng)來修復(fù)的，而其中DNA糖苷酶就是用來修復(fù)DNA錯(cuò)配的蛋白家族之一［6］。

胸腺嘧啶糖苷酶(TDG)是尿嘧啶糖苷酶(UDG)超家族的重要一員，它既具有修復(fù)5-甲基胞嘧啶自發(fā)水解脫氨基產(chǎn)生的G:T錯(cuò)配的能力，也具有像其他尿嘧啶糖苷酶家族一樣具有修復(fù)G:U錯(cuò)配的能力［7-8］。此外，有不少研究發(fā)現(xiàn)TDG不僅僅具有DNA錯(cuò)配修復(fù)功能，還與基因表達(dá)調(diào)控、CPG島甲基化調(diào)控、胚胎發(fā)育以及腫瘤的發(fā)生與治療等都有密切關(guān)系。此前就有不少文獻(xiàn)報(bào)道，TDG能通過多種方式抑制腫瘤的發(fā)生。其中，TDG作為UDG家族的一員就介導(dǎo)了5-FU、FdUrd等化療藥物治療腫瘤的代謝過程［9］。此外，也有文獻(xiàn)報(bào)道TDG的G:T錯(cuò)配修復(fù)功能也可能與化療相關(guān)［10-11］。本實(shí)驗(yàn)室近年來圍繞TDG的結(jié)構(gòu)與功能關(guān)系開展了系列研究［12-14］，而本研究主要著眼于TDG修復(fù)G:U錯(cuò)配的結(jié)構(gòu)與功能關(guān)系研究，以期為以后的生物學(xué)功能研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1． 1 實(shí)驗(yàn)材料與試劑

原核表達(dá)載體pET28a(+)購自Novagen公司，大腸桿菌E coli克隆菌株Top10及表達(dá)菌株BL21(DE3)由本實(shí)驗(yàn)室保存。PCR試劑、限制性內(nèi)切酶XhoⅠ和NdeⅠ、Taq DNA Polymerase、T4DNA Ligase、Pyrobest DNA聚合酶均購自TaKaRa公司。柱離心式質(zhì)粒小提試劑盒和柱離心式膠回收小提試劑盒購自上海申能博彩公司。

1． 2 實(shí)驗(yàn)方法

1．2.1 PCR擴(kuò)增mTDG的C-端截短基因片段mTDG

(1-279) 以載體pCI-HA-TDG為模板，用高保真酶

Pyrobest DNA聚合酶PCR擴(kuò)增只含有編碼1-279位氨基酸殘基的基因片段，即mTDG(1-279)(圖1)。所用的上下游引物分別為:

在上游引物中有NdeⅠ酶切位點(diǎn)(斜黑體下劃線)，下游引物中有XhoⅠ的酶切位點(diǎn)(斜黑體下劃線)。PCR反應(yīng)條件為:94℃熱變性30 s，60℃退火30 s，72℃延伸1 min，共進(jìn)行26個(gè)循環(huán)。對(duì)PCR產(chǎn)物行DNA瓊脂糖凝膠電泳分離，切膠回收。

圖1 mTDG蛋白及mTDG(1-279)蛋白的結(jié)構(gòu)Fig 1 Schematic overview of the domain structure of mTDG and mTDG(1-279)

1．2.2 構(gòu)建重組質(zhì)粒pET28a-mTDG(1-279) 將回收得到的基因片段mTDG(1-279)經(jīng)NdeⅠ和XhoⅠ雙酶切3 h后，并經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分離且回收后插入到同樣經(jīng)NdeⅠ和XhoⅠ雙酶切回收的pET28a(+)載體中。用T4DNA Ligase連接，16℃過夜反應(yīng)，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化Top10感受態(tài)細(xì)胞，熱擊、活化，涂布于含有Kan+抗生素的LB平板上，37℃倒置培養(yǎng)12 h。挑取單菌落進(jìn)行菌落PCR篩選陽性克隆，并經(jīng)NdeⅠ和XhoⅠ雙酶切鑒定以及DNA測(cè)序，分析其閱讀框和編碼序列的正確性。

1．2.3 His-mTDG(1-279)蛋白的表達(dá)與純化 構(gòu)建好的重組質(zhì)粒pET28a-mTDG(1-279)轉(zhuǎn)化表達(dá)菌株BL21(DE3)，挑取單克隆到含 60 μg·ml－1卡那霉素的3 ml LB液體培養(yǎng)基過夜活化培養(yǎng)，然后按1∶100的比例轉(zhuǎn)接入 300 ml含60 μg·ml－1卡那霉素的 LB 液體培養(yǎng)基中，先37℃培養(yǎng)3 h左右至菌液濃度OD600nm=0.7～0.9時(shí)，再將培養(yǎng)瓶冷卻至20℃，然后加入IPTG到終濃度為0.2 mmol·L－1誘導(dǎo)表達(dá)，16 h后收集菌體，超聲裂解 20 min(脈沖 3 s，間隔 3 s)，12 000 r·min－1離心 10 min。將收集的上清以 0.5 ml·min－1的速率加載到已經(jīng)用Tris-HCl緩沖液預(yù)平衡過的Ni+親和柱上，上完樣后用Tris-HCl緩沖液充分洗滌至基線，再用含有50 mmol·L－1咪唑的緩沖液洗滌雜蛋白，最后用含250 mmol·L－1咪唑的緩沖液洗脫目的蛋白。再將通過 Ni+親和柱純化的洗脫蛋白立即使用Sephadex G15凝膠柱層析去除咪唑。純化后的蛋白加入10%的甘油后，保存在－80℃?zhèn)溆谩?/p>

1．2.4 mTDG(1-279)蛋白對(duì)G/U錯(cuò)配修復(fù)的體外活性分析 mTDG(1-279)蛋白的活性分析參照文獻(xiàn)［12］進(jìn)行，首先在U-44(5'-AATTGGGCTCCTCGAGGAATTU GCCTTCTGCAGGCATGCCCCGG-3')的5'端帶上 ROX熒光標(biāo)記(由Invitrogen公司合成)，然后與G-44(5'-C CGGGGCATGCCTGCAGAAGGCGAATTCCTCGAGGAGC CCAATT-3')配對(duì)退火形成含有U:G錯(cuò)配的異源雙鏈，即用于測(cè)活的底物。測(cè)活反應(yīng)體系為:50 mmol·L－1Tris-HCl(pH 8.0)，1 mmol·L－1DTT，50 μg·ml－1BSA，1 mmol·L－1EDTA，3%甘油，含有 U:G 錯(cuò)配的雙鏈底物0.3 mmol·L－1和適量的 mTDG(1-279)蛋白，10 μl反應(yīng)體系。先在37℃水浴反應(yīng)30 min，再加入1．1 μl 1 mol·L－1NaOH，90 ℃反應(yīng) 30 min 后，迅速置冰上5 min，短暫離心后，加入5 μl測(cè)活loading(90%formamide，10 mmol·L－1EDTA，0.1%xylene cyanol，0.1%bromophenol blue)。最后取10 μl混合物上樣，在14%聚丙烯酰胺測(cè)序膠進(jìn)行電泳分離，電泳完畢后用Typhoon 9410 workstation(Amersham公司)進(jìn)行掃描與分析。

2 結(jié) 果

2． 1PCR 擴(kuò)增mTDG(1-279)基因片段

按標(biāo)準(zhǔn)反應(yīng)體系及以上條件PCR擴(kuò)增得到mTDG(1-279)基因片段，PCR產(chǎn)物用DNA瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行分離，結(jié)果顯示大小正確(837 bp，圖2)，之后切膠并回收。

圖2 mTDG(1-279)的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物Fig 2 The PCR product of gene encoding mTDG(1-279)

2． 2 重組質(zhì)粒pET28a-mTDG(1-279)的構(gòu)建

mTDG(1-279)片段經(jīng)PCR擴(kuò)增、酶切，然后與酶切過的pET28a(+)表達(dá)載體連接，轉(zhuǎn)化Top10感受態(tài)細(xì)胞，挑取克隆經(jīng)菌落PCR鑒定、雙酶切鑒定(圖3)，最后通過DNA測(cè)序分析證明mTDG(1-279)片段已成功插入載體中，其閱讀框序列保持一致。

2． 3His-mTDG(1-279)的表達(dá)及純化

［14］中TDG表達(dá)純化的條件，我們確定了表達(dá)His-mTDG(1-279)條件，就是在低溫20℃和低IPTG濃度0.2 mmol·L－1時(shí)，能夠很好地表達(dá)且大部分在可溶上清里。我們通過Ni+柱親和純化及使用Sephadex G15凝膠柱層析去除咪唑后，用12%SDSPAGE膠電泳檢測(cè)蛋白表達(dá)情況(圖4)，可知獲得了比較單一條帶的His-mTDG(1-279)融合蛋白。此外，用Bradford法測(cè)純化得到的蛋白濃度，可以有37 mg·L－1的得率，可用于體外測(cè)活。

圖3 重組質(zhì)粒pET28a-mTDG(1-279)的酶切鑒定分析Fig 3 Identification of pET28a-mTDG(1-279)by restriction endonuclease digestion

圖4 mTDG(1-279)蛋白表達(dá)純化的SDS-PAGE分析Fig 4 SDS-PAGE analysis of the expression and purification of mTDG(1-279)protein

2． 4 G:U錯(cuò)配修復(fù)的體外活性分析

參考經(jīng)典的TDG體外測(cè)活實(shí)驗(yàn)以及經(jīng)我們改進(jìn)過的測(cè)活方法，將純化的mTDG(1-279)蛋白與含有G:U錯(cuò)配的異源雙鏈混合反應(yīng)，并進(jìn)行分析，結(jié)果顯示mTDG(1-279)蛋白能使異源雙鏈斷裂產(chǎn)生產(chǎn)物，即表明mTDG(1-279)蛋白具有良好的U:G錯(cuò)配修復(fù)活性(圖5)。

3 討 論

胸腺嘧啶糖苷酶是一個(gè)重要的DNA糖苷酶，它主要修復(fù)5-甲基胞嘧啶自發(fā)水解脫氨基產(chǎn)生的G:T錯(cuò)配，但同時(shí)它又具有修復(fù)G:U錯(cuò)配的能力。從以前的研究得知，它的錯(cuò)配修復(fù)功能與腫瘤治療有密切關(guān)系。近年來，國(guó)際上對(duì)TDG其他功能的研究也取得了長(zhǎng)足的發(fā)展。例如TDG缺陷型或TDG失活的胚胎無法發(fā)育成功會(huì)壞死，表明TDG在維持表觀遺傳穩(wěn)定方面起著重要的作用［15-16］。近年來，本研究室圍繞TDG的結(jié)構(gòu)與功能關(guān)系展開了深入研究。在之前的研究中，我們已經(jīng)就TDG抗體的制備、活性測(cè)定的改進(jìn)、G:T錯(cuò)配的體外、體內(nèi)測(cè)活及其功能等方面展開了深入的研究。

圖5 mTDG(1-279)蛋白修復(fù)G:U錯(cuò)配的活性分析Fig 5 The activity assay of mTDG(1-279)protein

mTDG由421個(gè)氨基酸殘基組成，此前文獻(xiàn)報(bào)道其維持G:T錯(cuò)配修復(fù)的活性結(jié)構(gòu)域?yàn)?7-374位氨基酸，維持G:U錯(cuò)配修復(fù)的活性結(jié)構(gòu)域?yàn)?23-374位氨基酸［7，17-19］(如圖1 所示)，但是這只是粗略地界定而沒有被具體精確地界定。在本研究中，我們通過構(gòu)建mTDG的C-端截短變體mTDG(1-279)，經(jīng)表達(dá)、純化，獲得了mTDG(1-279)變體蛋白，并進(jìn)行了G:U錯(cuò)配修復(fù)活性分析。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明mTDG(1-279)仍然具有良好的G:U錯(cuò)配修復(fù)活性。因此，我們發(fā)現(xiàn)其維持G:U錯(cuò)配修復(fù)的活性結(jié)構(gòu)域應(yīng)該在1-279位氨基酸的更小范圍，此外我們可以借助該方法精確地定位出TDG修復(fù)G:U錯(cuò)配的活性結(jié)構(gòu)域，為后期的生物學(xué)功能研究打好基礎(chǔ)。

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